[发明专利]菠萝AcKNOX1基因、克隆方法、表达载体及应用

权利要求书

1.一种菠萝AcKNOX1基因，其特征在于：该基因序列具有序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.一种菠萝AcKNOX1基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以菠萝为材料，利用CTAB法提取总RNA；

(2)AcKNOX1基因的克隆；

(2-1)利用Transgene公司的Trans-Uni One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix Kit将RNA反转录为cDNA，作为PCR模板备用；

(2-2)设计全长cDNA扩增引物；

(2-3)根据引物的Tm值进行PCR条件的优化后，进行PCR扩增，并将获得的产物连接到大肠杆菌，经PCR和酶切鉴定后进行序列测定。

3.根据权利要求2所述的菠萝AcKNOX1基因的克隆方法，其特征在于，步骤(1)总RNA的提取具体如下：

(1-1)准备工作：将研钵提前放入烘箱180℃烘4h后冷却至室温待用，实验过程中所要用的移液枪、实验台均用酒精擦拭，离心管、枪头均无RNA酶；

(1-2)取850μl CTAB缓冲液到2ml离心管中，放入65℃水浴锅预热；

(1-3)称取0.2g材料于加入液氮的研钵中充分研磨，待材料呈粉末状即可转入(1-2)中预热的离心管中，加入材料前先加入25μlβ-巯基乙醇；

(1-4)立即涡旋30s混匀，65℃水浴6min；

(1-5)加入等体积氯仿/异戊醇，剧烈震荡，开盖放气，涡旋30s，室温11000rpm离心15min；

(1-6)吸取上清于新2ml离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇，再抽提一次，涡旋30s，室温11000rpm离心15min；

(1-7)吸取上清于新1.5ml离心管中，加入1/3体积8mol/l LiCl，颠倒混匀，在4℃下沉淀10-12h，不要超过16h；

(1-8)4℃下，11000rpm离心30min，弃上清，用75％乙醇500μl洗涤沉淀两次，弃去液体，风干；

(1-9)加入30-40μl RNase-free水溶解沉淀；

(1-10)取2μl RNA样品用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，取2μl RNA样品用SimpliNano微量分光光度计测定样品的浓度与纯度，剩余RNA样品于-80℃保存备用，保存时间不要超过一周。

4.根据权利要求2所述的菠萝AcKNOX1基因的克隆方法，其特征在于，步骤(2-2)中的扩增引物包括AcKNOX1-F和AcKNOX1-R，序列分别如序列表中的SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。

5.一种菠萝AcKNOX1基因表达载体，其特征在于：利用了权利要求1所述的菠萝AcKNOX1基因为目的基因的表达载体。

6.根据权利要求5所述的菠萝AcKNOX1基因表达载体，其特征在于：用权利要求1所述的菠萝AcKNOX1基因插入到植物表达载体CaMV35S-gfp上，构建成在CaMV35S启动子下游含有菠萝AcKNOX1基因的高效表达载体。

7.根据权利要求6所述的菠萝AcKNOX1基因表达载体，其特征在于：根据已测序的AcKNOX1基因序列，设计在5’端加上15bp含KpnI酶切位点的上游引物P1和含XbalI酶切位点的下游引物P2，以AcKNOX1基因测序验证正确的菌液为模板，PCR扩增全长，并利用KpnI和XbaI限制性内切酶将CaMV35S-gfp载体线性化，采用T4连接酶构建重组载体，经过菌液PCR及双酶切检测验证后获得AcKNOX1基因表达载体。

8.根据权利要求7所述的菠萝AcKNOX1基因表达载体，其特征在于：所述上游引物P1和下游引物P2的序列如序列表中的SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。

9.一种权利要求1-8任何一项所述的菠萝AcKNOX1基因对菠萝叶刺形成影响的应用。