[发明专利]蜻蜓凤梨AfCAL基因、克隆方法、表达载体及应用

说明书

本发明公开蜻蜓凤梨AfCAL基因、克隆方法、表达载体及应用，提取蜻蜓凤梨总RNA，反转录合成cDNA，以此为模板，设计特异引物，利用PCR方法获得AfCAL基因的全长cDNA，与载体连接，转化大肠杆菌Trans‑T1感受态细胞，挑取阳性克隆得到蜻蜓凤梨AfCAL基因，该基因的cDNA全长1315bp，编码含253个氨基酸残基的蛋白质。利用实时荧光定量PCR测定了蜻蜓凤梨不同组织器官AfCAL基因的表达水平，AfCAL在蜻蜓凤梨中的表达量较高，说明蜻蜓凤梨AfCAL基因具有调控植物开花的功能。AfCAL基因的获得，为研究蜻蜓凤梨开花机理奠定了基础，为凤梨植物栽培中催花技术的提高提供了理论参考，具有重要的理论及实践意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及凤梨CAL基因、克隆、表达特性分析、表达载体构建和对开花的调控作用。

背景技术

凤梨科植物为多年生单子叶草本植物，包括重要的热带花卉(观赏凤梨)和重要的热带水果(菠萝)。凤梨的开花时间、花期长短以及花形态建成会影响其上市时间、上市周期以及果实品质等。近年来越来越多参与凤梨开花途径的基因被分离和鉴定，但是CAL基因在凤梨花序发育和开花机制中研究较少。

CAL(CAULIFLOWER)是控制花分生组织发育和调控花发育的基因，属于MADS-box转录因子编码基因，在拟南芥中，AP1(APETALA1)和CAL双突变使花分生组织保持无限分生特性，能形成和花椰菜相似的花球表型。而花椰菜中BobCAL基因单突变就能形成花球。虽然CAL基因与AP1基因在序列和结构上较相似，但在MADS结构域和K结构域的差异，对花器官原基的形成、花分生组织以及花瓣和萼片原基等有相互作用的影响，其功能上依然存在一定差异。MADS-box转录因子往往与多个蛋白质形成同源或异源复合体来发挥特定功能，CAL和AP1功能的不同也很可能是其互作因子存在差异。已有研究分别筛选了拟南芥中CAL和AP1的互作因子，二者的确存在各自特异的互作蛋白，也同时存在共有的互作因子。

通过蜻蜓凤梨(Aechmea fasciata)比较转录组信息分析获得了CAL基因的片段，BLAST对比显示均与其他植物中的CAL基因具有较高的同源性，定名为AfCAL。实时荧光定量PCR结果表明，AfCAL基因在蜻蜓凤梨各器官中表达量存在显著差异。利用PCR克隆了基因的全长序列并构建表达载体，在拟南芥中过表达后促进了拟南芥开花。说明蜻蜓凤梨AfCAL基因具有调控植物开花的功能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蜻蜓凤梨AfCAL基因，提取蜻蜓凤梨总RNA，反转录合成cDNA，以此为模板，设计特异引物，利用PCR方法获得AfCAL基因的全长cDNA，与-blunt载体连接，转化大肠杆菌Trans-T1感受态细胞，挑取阳性克隆得到蜻蜓凤梨AfCAL基因，该基因的cDNA全长1315bp。AfCAL基因的获得，为研究蜻蜓凤梨开花机理奠定了基础，为凤梨植物栽培中催花技术的提高提供了理论参考，具有重要的理论及实践意义。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种蜻蜓凤梨AfCAL基因，该基因序列具有序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明的另一目的在于提供一种蜻蜓凤梨AfCAL基因的克隆方法，包括以下步骤：

(1)以蜻蜓凤梨(Aechemia fasciata)为材料，利用CTAB法提取总RNA；

(2)AfCAL基因的克隆；

(2-1)利用Trans-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA SynthesisSuperMix(Transgene)试剂盒将RNA反转录为cDNA，作为PCR模板备用；

(2-2)设计全长cDNA扩增引物；

AfCAL基因cDNA全长克隆引物