[发明专利]一种单细胞原位培养芯片及其原位纯培养物的分离方法

说明书

本发明一种单细胞原位培养芯片及其原位纯培养物的分离方法，包括：在金属镀膜玻璃片上，覆盖一层微孔膜，形成微孔分选芯片，在所述微孔膜上面覆盖一层纳米级聚合物膜，上述三层结构共同构成具备多组微型扩散室的原位培养芯片，可为微型扩散室内的细胞提供天然存在的生长因子和营养物质，使那些在实验内不可培养的微生物物种在自然环境中原位生长。降低了物种培养随机性，提高样品中微生物在单个环境内培养率，满足有效高通量地分离单个微生物，实现从各种环境中平行培养和分离以前未培养的微生物物种。

技术领域

本发明专利涉及材料、光学和生物医学工程等新兴交叉类技术领域，尤其是一种单细胞原位培养芯片及其原位纯培养物的分离方法，实现了实验中“不可培养”的微生物物种的高通量单细胞的原位培养。

背景技术

自然界超过99％的微生物物种不会在体外合成培养基上生长，rRNA和宏基因组学方法证明了这些未栽培物种的惊人多样性。同时几乎每个治疗领域——自身免疫性疾病、传染病、中枢神经系统、代谢疾病，甚至癌症——都以某种方式与微生物菌群的改变相关联。因此，获取这种“缺失”的微生物多样性对基础科学和应用科学都具有重要意义。

然而，人们对微生物的分析都是基于群体细胞的平均水平，这模糊了我们对微生物多样性的了解，掩盖了细胞功能性表型与基因的对应关系，丢失了单细胞异质性信息。

为了解决这一挑战，人们开发了一种在原位扩散室内培养微生物的方法。这种方法的基本原理是扩散将为室内的细胞提供天然存在的生长因子，并使那些在实验内“不可培养”的微生物物种放在自然环境的扩散室内生长。这种方法产生的微生物回收率比实验室标准技术高出许多倍。即便如此，这种方法很费力，随机性强，扩散室数量少，无法保证样品中微生物都在单个扩散室内培养，并且不能有效、高通量地分离大量单个微生物，这限制了该方法的适用性。

单细胞分选技术研究是当前国内外生物学研究热点。基于激光诱导前向转移(Laser Induced Forward Transfer,LIFT)原理的单细胞分选技术，能够在显微条件下，精准分选指定的单细胞用于基因分析，在生物、医学、食品等领域研究中应用广泛。

然而，LIFT技术存在一定局限性，在LIFT分选过程中无法在液体中实现单细胞捕获，一次可能分选多个细胞，并且激光作用牺牲层产生高温的蒸汽，生成的热量被牺牲层附近的细胞吸收，导致细胞损伤、死亡，这使得单细胞活体分选成功率大大降低，失去较大科研价值。目前，尚无一种在液体中有效实现单细胞捕获和降低分选损伤的可视化精准单细胞活体分选方法。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种单细胞原位培养芯片及其原位纯培养物的分离方法，通过特殊的三层结构芯片设计，降低了物种培养随机性，提高样品中微生物在单个环境内培养率，满足有效高通量地分离单个微生物，实现从各种环境中平行培养和分离以前未培养的微生物物种。

为解决上述技术问题，本发明提供一种单细胞原位培养芯片及其原位纯培养物的分离方法，其中：

一种单细胞原位培养芯片，包括：

在金属镀膜玻璃片上，覆盖一层微孔膜，形成微孔分选芯片，在所述微孔膜上面覆盖一层纳米级聚合物膜。上述三层结构共同构成具备多组微型扩散室的原位培养芯片，可为微型扩散室内的细胞提供天然存在的生长因子和营养物质，使那些在实验内不可培养的微生物物种在自然环境中原位生长。

进一步的，所述微孔膜为生物兼容性薄膜，采用微纳加工工艺覆盖在金属镀膜玻璃片上；

作为一种举例说明，所述金属镀膜玻璃片是指：通过磁控溅射方式将纳米级金属薄膜涂覆在玻璃片上。

作为一种举例说明，所述纳米级聚合物膜可以是0.1μm以下孔径的聚碳酸酯膜或醋酸纤维素滤膜等。