[发明专利]一种快速获得萝卜转基因材料的方法

说明书

本发明涉及一种快速获得萝卜转基因材料的方法，包括：对萝卜种子进行消毒种植无菌苗；活化携带目的基因的发根农杆菌；制备侵染液；获取无根苗外植体并浸入菌液进行侵染；经过共培养和脱菌培养30d后，通过表型筛选、PCR检测和qRT‑PCR分析鉴定阳性毛状根；切取阳性毛状根放置于愈伤组织培养基上诱导愈伤组织，获得转基因愈伤组织。本发明提高了发根农杆菌诱导萝卜毛状根的效率，缩短了发根时间，成功诱导了转基因愈伤组织，能够进行萝卜部分本体基因功能验证。

技术领域

本发明属于萝卜转基因体系技术领域，涉及发根农杆菌介导的萝卜遗传转化体系的建立方法，以及以转基因毛状根为外植体获得转基因愈伤组织方法的优化。

背景技术

萝卜(Raphanus sativus L.)为十字花科萝卜属一、二年生草本植物，营养丰富，食疗保健价值高，在我国蔬菜生产和周年供应中占有重要地位。目前，随着萝卜基因组序列的公布以及转基因工程等现代生物技术的快速发展，给萝卜种质遗传改良提供了新的思路和选择。发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)可通过Ri质粒诱导植物产生生理性状和遗传性稳定的毛状根，同时将外源基因共同整合到植物基因组中，从而实现目的基因的遗传转化。发根农杆菌介导的遗传转化具有周期短、操作简单和应用范围广等优点，已成为植物基因功能验证和根系生物学研究的有力工具。然而，目前尚未见对发根农杆菌介导萝卜遗传转化的影响因素进行综合分析的研究报道，没有建立高效的转化体系。通过发根农杆菌诱导萝卜产生不定根，提高了转化的效率，能够进行部分基因功能在萝卜本体中的验证。

发明内容

本发明提供了一种快速获得萝卜转基因毛状根和以毛状根为外植体诱导转基因愈伤组织的体系，为萝卜基因功能的验证提供了有效方法。与其他的瞬时转化和异源转化相比，发根农杆菌介导的遗传转化体系更便捷、稳定。

本发明的具体技术方案如下：

一种快速获得萝卜转基因材料的方法，包括以下步骤：

(1)对萝卜种子进行消毒，将消毒后的种子播种到灭菌的MS培养基上获得无菌苗。

(2)活化携带目的基因的发根农杆菌。

(3)侵染无菌苗的前一天使用LB液体培养基摇菌。

(4)待无菌苗生长到6-7d时，切除实生根获得无根苗，使用步骤(3)中的菌液侵染无根苗。

(5)侵染后的植株在无菌滤纸上晾干，随后接种到MS培养基上共培养2d。

(6)共培养结束后，将植株转移到脱菌培养基上进行培养。

(7)培养30d后，对发出的毛状根进行表型鉴定，提取DNA和RNA进行PCR检测和qRT-PCR分析，检测目的基因是否成功转入毛状根并过量表达。

(8)以转基因毛状根为外植体诱导转基因愈伤组织。

所述的发根农杆菌为MSU440菌株，属于农杆碱型发根农杆菌。

步骤(1)中，采用75％的乙醇消毒1.5min，8％的次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗3次，在无菌滤纸上晾干，完成种子灭菌过程。

步骤(2)中，携带目的基因的发根农杆菌菌液保存在-80℃冰箱中，使用LB固体培养基进行活化；

所述的LB固体培养基为：在每升的LB培养基中添加100mg/L卡那霉素(Kan)+50mg/L链霉素(Str)+15g/L琼脂。

步骤(2)中，使用灭菌枪头吸取20μL菌液，在LB固体培养基上划线后密封，倒置于28℃恒温培养箱培养2d，待菌落长出。

步骤(3)中，使用灭菌枪头刮取菌落转移到LB液体培养基中，于28℃，220rmp恒温摇床培养8-12h。