[发明专利]一种快速获得萝卜转基因材料的方法

权利要求书

1.一种快速获得萝卜转基因材料的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)对萝卜种子进行消毒，接种到MS培养基上，获得无菌苗；

(2)携带目的基因的发根农杆菌菌液活化与侵染液制备；

(3)外植体制备与侵染；

(4)共培养、脱菌培养及毛状根诱导；

(5)根据表型或载体荧光标记筛选转基因毛状根；

(6)DNA、RNA提取和反转录，PCR检测和qRT-PCR分析；

(7)将转基因毛状根切成0.5em的小段接种至愈伤组织培养基上诱导转基因愈伤组织。

2.如权利要求1所述的一种快速获得萝卜转基因材料的方法，其特征在于：步骤(1)中，消毒方式为采用75％的酒精消毒1.5min，8％次氯酸钠消毒10min，随后用无菌水冲洗3次；MS培养基成分为：41.74g/L MS(含琼脂(Agar)和蔗糖(Sucrose))；无菌苗于25℃，光照时长为16h/d的条件下培养。

3.如权利要求1所述的一种快速获得萝卜转基因材料的方法，其特征在于：步骤(2)中含有目的基因的发根农杆菌菌液保存在-80℃冰箱中，活化农杆菌的培养基为：20g/L LB+15g/L琼脂+100mg/L卡那霉素(Kanamycin，Kan)+50mg/L链霉素(Streptomycin sulfate，Str)；摇菌时培养基为：20g/L LB+100mg/L Kan+50mg/L Str；侵染液制备时，采用1/2MS液体培养基，将菌液OD₆₀₀值调节至1.0，菌液中添加300μmol/L的乙酰丁香酮(AS)，侵染过程在28℃，220rmp摇床中进行；1/2MS液体培养基的成分为4.6g/L 1/2MS+30g/L蔗糖。

4.如权利要求1所述的一种快速获得萝卜转基因材料的方法，其特征在于：步骤(3)中取6-7d苗龄无菌苗，从生长点向下1cm处快速切断获得无根苗外植体，将无根苗浸入OD₆₀₀＝1.0的菌液中侵染10min，用无菌水冲洗3次，随后在无菌滤纸上完全晾干。

5.如权利要求1所述的一种快速获得萝卜转基因材料的方法，其特征在于：步骤(4)中共培养培养基为41.74g/L MS培养基，共培养在黑暗条件下进行，时间为2d，；脱菌培养基为41.74g/L MS+300mg/L头孢噻肟霉素(Cef)，脱菌培养30d左右。

6.如权利要求1所述的一种快速获得萝卜转基因材料的方法，其特征在于：步骤(6)提取DNA的方法为CTAB法；DNA检测的PCR反应体系如下：总体积为10μL，其中Taq酶Mix 5μL、引物F(10μM)和引物R(10μM)各0.5μL、模板DNA(20ng/μL)1μL、ddH₂O 3μL。

PCR反应程序：

7.如权利要求1所述的一种快速获得萝卜转基因材料的方法，其特征在于：步骤(6)中RNA提取与反转录方法参照总RNA提取试剂盒(RNAsimple Total RNA Kit)和反转录试剂盒(Reverse Transcription Kit)。qRT-PCR反应体系如下：体系为15μL，其中，2×SYBR greenreaction mix 7μL，引物F(10μM)和引物R(10μM)各0.56μL，cDNA(20ng/μL)，ddH₂O 3μL。

qRT-PCR反应程序：

8.如权利要求1所述的一种快速获得萝卜转基因材料的方法，其特征在于：步骤(7)中愈伤诱导培养基成分为：41.74g/L MS(含琼脂(Agar)和蔗糖(Sucrose))+0.75mg/L噻二唑苯基脲(TDZ)+0.5mg/L萘乙酸(NAA)+300mg/L Cef。