[发明专利]一种酶活提高的双果糖酐水解酶突变体E389A

说明书

本发明公开了一种酶活提高的双果糖酐水解酶突变体E389A，属于基因工程技术领域。本发明对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的双果糖酐水解酶的第389位氨基酸定点突变，得到双果糖酐水解酶突变体E389A。本发明提供的双果糖酐水解酶E389A的最适pH为6.5，最适反应温度为55℃，酶活和催化效率相比野生酶分别提高了3.6倍和4倍。对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的双果糖酐水解酶的第389位氨基酸定点突变提高了双果糖酐水解酶的生产能力和催化效率，为工业中菊二糖生产提供了优良催化剂，有助于降低生产成本，为菊二糖的研究奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种酶活提高的双果糖酐水解酶突变体E389A，属于基因工程技术领域。

背景技术

果聚糖在自然界中普遍存在，是一种由果糖基连接成的碳水化合物的总称。果聚糖不仅存在于双子叶植物中，可以提高植物的耐旱能力，起到液泡渗透缓冲剂和低温保护剂的作用。果聚糖也大量存在于细菌和真菌中用以保护细胞和防止失水。

自然界中存在两种果聚糖，按照果糖基之间糖苷键的差异，可分为β-(2，1)键连接的菊糖和β-(2，6)键连接的Levan果聚糖。Levan果聚糖在自然界中含量极少，而菊糖大量存在于菊科植物中，价格比较便宜，作为一种益生元和膳食纤维应用比较广泛。

菊糖其中一条代谢途径是先通过菊糖果糖转移酶被转化成为益生元双果糖酐。双果糖酐在人体上消化道中不被消化吸收，到达大肠后被肠道微生物中的双果糖酐水解酶水解为菊二糖，菊二糖进一步被微生物果糖苷酶水解成为果糖而被人体吸收利用。另一条途径是通过菊粉酶将菊糖转化为低聚果糖，低聚果糖里包括果糖，菊二糖，菊三糖，菊四糖等混合物，具有重要的生理功能。这两条途径都有菊二糖生成，而且对菊糖、双果糖酐、果糖的研究较为透彻，但是对于菊二糖的研究较少，其生理功能未有相关报道，理化性质研究也鲜有报道。基于其他糖都具有重要生理功能，推测菊二糖也是一种功能糖。市场上并无菊二糖纯样品出售，这可能限制了生产和性质研究，而且菊二糖的合成主要是利用双果糖酐水解酶水解获得。但双果糖酐水解酶活力较低，因此，筛选新的酶或者理性设计改造现有的双果糖酐水解酶使其能够高效生产菊二糖就十分必要。

发明内容

为了解决上述问题，本发明通过对微生物Arthrobacter chlorophenolicusA6来源的双果糖酐水解酶进行分子改造，获得酶活和催化效率都显著提高的双果糖酐水解酶突变体。

本发明提供了一种双果糖酐水解酶突变体，所述突变体是在Arthrobacterchlorophenolicus A6来源的双果糖酐水解酶的基础上将第389位谷氨酸突变为丙氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物Arthrobacter chlorophenolicusA6来源的双果糖酐水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明提供了编码所述双果糖酐水解酶突变体的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明提供了携带所述基因的重组载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组载体包括但不限于pET系列质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述重组载体以pET-22b(+)为表达载体。

本发明提供了携带所述基因或所述重组载体的微生物细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞以细菌或真菌为表达宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞以大肠杆菌为表达宿主。