[发明专利]一种158位突变的醛酮还原酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种酿酒酵母来源的醛酮还原酶SceCPR半理性设计及其生物催化应用，属于蛋白质工程领域。本发明通过同源建模、分子比对和分子对接，提供了醛酮还原酶突变体，将序列表中氨基酸序列2所示的第158位丝氨酸突变为丙氨酸SceCPR^S158A，获得酶活力提高的醛酮还原酶突变体。SceCPR、SceCPR^S158A的比酶活分别为32.62U/mg、119.4U/mg，SceCPR^S158A比酶活提高了3.66倍。

技术领域

本发明涉及醛酮还原酶突变体(SceCPR^S158A)的构建和表达，以及该酶的性质和制备研究，属于基因工程和酶学研究技术领域。

背景技术

D-泛酸(D-Pantothenic acid,PA)又称维生素B5，存在于植物以及部分微生物中，具有多种生理功能。首先，泛酸作为能量物质参与代谢，不仅是大脑神经所必需的物质，还可以保持血液、皮肤和头发的健康。其次，泛酸作为辅酶A 的合成前体，辅助脂肪酸和脂质的生物合成反应，D-泛酸缺乏时会抑制辅酶A的生产，导致自由基清除效率和磷脂的合成效率下降，最终影响神经系统以及代谢功能的运转。

D-泛解酸内酯(D-Pantolactone,D-PL)是合成D-泛酸的重要前体物质，也可以用于合成异戊二烯、软体毒剂Cyanoide A大分子内酯化合物和D-(-)-noviose等物质。D-PL的合成方法包括化学法、酶法和化学酶法。D-PL的化学合成法是以甲醛和异丁醛为起始原料，经醛缩合、腈化及内酯化等反应生成D/L-PL，再经选择性拆分得到D-PL，整个过程工艺成熟，但总体反应步数较多，反应条件严苛，且酸碱用量大和能耗较高。生物技术的发展为生物酶法合成D-PL提供了重要的可行性。目前工业化合成D-PL采用的是化学法与水解酶拆分法相结合的技术路线。即D/L-PL在D-泛解酸内酯水解酶作用下，选择性水解生成D-泛解酸，D-泛解酸再经内酯化生成D-PL，而留下的L-PL再经化学消旋化为D/L-PL重新进行循环拆分。

氧化还原法催化不对称还原酮泛解酸内酯(Ketopantolactone,KPL)也可以用于制备D-PL，具体的过程是D/L-PL在L-泛解酸内酯脱氢酶的作用下，将L-PL氧化成KPL，再利用酮泛解酸内酯还原酶将其不对称还原成D-PL。整个过程简单绿色，不需要化学法再消旋化。

早在1974年，King HL等人已经发现了一种来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的NADP(H)依赖型的酮泛解酸还原酶能够将KPL还原为D-PL。1989年，Hata H等人从S.cerevisiae NRRL Y-2034中发现了酮泛解酸内酯还原酶，并对其酶学性质进行了研究，发现其对醛酮类化合物靛红(Istain)及其衍生物具有非常高的亲和力，其中对KPL也具有较好的亲和力，K_m值为0.017mM。NADPH依赖性的酮泛解酸内酯还原酶属于醛酮还原酶(aldo-keto reductases，AKR)超家族。目前研究较多的CPR主要是源于Candidaparapsilosis IFO 0708的CPR-C1和CPR-2，以及S.cerevisiae中的SceCPR。2014年，Qin HM等人对CPR-C2的蛋白结构进行了解析，其结构由13个α螺旋和8个β折叠组成，并具有典型的磷酸丙糖异构酶结构口袋，属于典型AKR家族蛋白。Qin HM等人进一步又提出了CPR-C2的分子作用机制，揭示了其四个关键的催化位点Asp58、Tyr63、Lys88和His125，其中Tyr63与His125作为质子供体，Tyr63与Lys88形成的带电氢键促进了Tyr63的质子转移；Lys88与Asp58之间形成盐桥实现整个催化过程，此外，还揭示了CPR-C2辅酶结合位点(Gly26、Thr27、Ser161、Ser215、Leu217、Arg222、Thr260、Thr261)。