[发明专利]一种158位突变的醛酮还原酶突变体及其应用

权利要求书

1.一种醛酮还原酶突变体，其特征在于：所述突变体是将SEQ ID NO：2所示氨基酸序列进行如下突变获得：第158位丝氨酸突变为丙氨酸。

2.如权利要求1所述的醛酮还原酶突变体的编码基因。

3.含如权利要求2所述的编码基因的重组表达质粒。

4.如权利要求3所述的重组表达质粒，其特征在于：所述的重组表达质粒的载体为pEASY-Blunt E1，所述重组表达质粒是将所述编码基因插入pEASY-Blunt E1质粒的多克隆位点得到。

5.如权利要求4所述的重组表达质粒，其特征在于所述重组表达质粒按如下方法构建：

(1)以含有质粒pACYCDuet1-SceCPR/EsGDH的E.coli DH5α菌株为模板，以下列引物进行PCR扩增，对PCR产物进行纯化回收，得到目的基因：

SceCPR-F TCATCATCATATGGGCTCATTTCATCAGCAG

SceCPR-R GTTATGCTAGTCACACTTTCTGGGCCGC

所述质粒pACYCDuet1-SceCPR/EsGDH是将GenBank登录号为EGA59421.1的基因、GenBank登录号为KM817194.1的基因分别插入同一质粒pACYCDuet-1的酶切位点Nco I与Hind III之间、Nde I与Xho I之间得到的；

(2)以pEASY-Blunt E1质粒为模板，以下列引物进行PCR扩增，对PCR产物进行纯化回收，得到线性化载体：

pEASY-Blunt E1-F GAAAGTGTGACTAGCATAACCCCTTGGGGC

pEASY-Blunt E1-R ATGAGCCCATATGATGATGATGATGATGAGAACCC

(3)通过一步克隆试剂盒将步骤(1)所述的目的基因和步骤(2)所述的线性化载体进行连接，所得连接产物转入感受态细胞中，在含氨苄青霉素的培养基上进行筛选，挑取单克隆测序验证，提取质粒，得到所述野生型表达质粒；

(4)以步骤(3)所述的野生型表达质粒为模板，以以下引物进行全质粒定点突变PCR，所得PCR产物纯化后转入E.coli DH5α感受态细胞，在含氨苄青霉素的培养基上进行筛选，挑取单克隆测序验证，提取质粒，得到所述重组表达质粒：

S158A-F GGCGTGGCAAATTTTGCGGTGGAAGATTTGCAG

S158A-R AAAATTTGCCACGCCAATATTTTTGGCTTTACCTGACTT。

6.如权利要求3所述的重组表达质粒构建的重组基因工程菌。

7.如权利要求6所述的重组基因工程菌，其特征在于所述重组基因工程菌按如下方法构建：利用热激法将所述重组表达质粒转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，转化产物均匀涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，经37℃过夜培养，挑取单克隆测序验证，获得所述重组基因工程菌。

8.如权利要求1所述的醛酮还原酶突变体在催化酮泛解酸内酯进行不对称还原反应制备D-泛解酸内酯中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述应用为：以表达所述醛酮还原酶突变体的重组基因工程菌经诱导表达、蛋白纯化获得的纯酶为催化剂，以酮泛解酸内酯为底物，以NADPH为辅酶构建反应体系，在pH 6.0、35℃下进行不对称还原；所述反应体系中，所述纯酶的终浓度为0.5μg/mL，所述酮泛解酸内酯的终浓度为50mM，所述NADPH的终浓度为60μM。