[发明专利]一种重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白及制备方法

说明书

本发明公开了一种重组人凝血因子Ⅷ‑Fc融合蛋白及制备方法。所述融合蛋白为将凝血因子VIII和Fc融合在一起得到的融合蛋白；其包含两条肽链，一条为由凝血因子VIII和抗体的Fc融合而成的融合多肽，另一条为包含Fc的Fc多肽，两条肽链的Fc含有不同的氨基酸序列并通过二硫键形成异二聚体。实验证明，本发明制备的融合蛋白活性为11.43～89.47IU/mL，远大于现有技术报道产量，适用于大规模工业化生产，可有效解决血源FVIII不足的问题，填补血友病A治疗原材料缺乏的短板。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白及制备方法。

背景技术

凝血因子Ⅷ(FactorⅧ,FⅧ)是由肝脏中的肝窦内皮细胞和血管内皮细胞合成的糖蛋白，在止血过程中发挥着至关重要的作用。由于FⅧ缺乏引起的血友病称为血友病A(Haemophilia A,HA)，是临床上最普遍的血友病类型，约占血友病患者总数的80％以上。血友病A患者病情严重程度与FⅧ缺乏程度密切相关，其中重度血友病A患者体内FⅧ的含量小于正常人含量的1％，临床上表现为关节、肌肉、内脏及深部组织等自发性出血或外部损伤后出血不易凝固，出血量偏高，严重时甚至会危及患者生命。

血友病A的主要治疗方法为FⅧ替代疗法，即定期给血友病A患者输入FⅧ，维持患者体内FⅧ的含量不低于正常人含量的1％。但是内源性FⅧ的半衰期较短，约为12h左右，在儿童体内更短，患者需要隔天或每周3次进行静脉注射治疗。此外，传统的FⅧ制备方法是从人血液中进行提取和纯化，血液来源有限，成本高，易受到病毒污染，导致传统产品的安全性具有潜在风险。因此，采用基因工程途径生产重组FⅧ是急需解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何制备重组人凝血因子FVIII-Fc融合蛋白和/或如何提高人凝血因子FVIII蛋白的人工合成效率和/或如何提高人工合成人凝血因子FVIII蛋白的稳定性。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了融合蛋白。所述融合蛋白可为将凝血因子VIII和Fc融合在一起得到的融合蛋白。所述融合蛋白可包含两条肽链，一条肽链为由凝血因子VIII和抗体的Fc融合而成的融合多肽，另一条肽链为包含Fc的Fc多肽。所述融合多肽的Fc和所述Fc多肽的Fc含有不同的氨基酸序列。所述融合多肽的Fc和所述Fc多肽的Fc可通过二硫键形成异二聚体。

上文所述融合蛋白中，所述融合多肽的Fc可包含IgG1的铰链区、CH2和CH3。所述Fc多肽的Fc也可包含IgG1的铰链区、CH2和CH3。所述融合多肽的Fc引入了S354C、D356E、L358M、T366W和N434A突变；所述Fc多肽的Fc引入了Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A、Y407V和N434A突变。所述融合多肽的Fc和所述Fc多肽的Fc均可来自于人IgG1。上述各个突变的位置均为抗体的Eu编号方案位置。

上文所述融合蛋白中，所述融合多肽的Fc可为下述任一种多肽：

A1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.2的第1463-1689位氨基酸残基的多肽；

A2)将A1)所示的多肽经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到与A1)具有90％以上的同一性的多肽；

A3)在A1)或A2)所示的多肽的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合多肽。

所述Fc多肽的Fc可为下述任一种多肽：

B1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.4的第21-247位氨基酸残基的多肽；

B2)将B1)所示的多肽经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到与B1)具有90％以上的同一性的多肽；

B3)在B1)或B2)所示的多肽的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合多肽。