[发明专利]一种hsa-miR-130b过表达的A549稳转细胞株及其构建方法

权利要求书

1.一种hsa-miR-130b过表达的A549稳转细胞株，其特征在于，是将miR-130b基因片段插入pLVX--IRES-Neo-EGFP载体，再转入A549细胞株，在细胞中表达miR-130b，经阳性细胞克隆筛选，A549细胞内源性miR-130b在A549细胞中高表达。

2.一种hsa-miR-130b过表达的A549稳转细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)hsa-miR-130b-3p过表达载体构建：以正常人血液基因组DNA为模板通过PCR扩增miR130b基因，通过酶切反应将mir130b克隆至真核表达载体pLVX--IRES-Neo-EGFP中，所得的重组病毒质粒与另外三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，用转染试剂Lipofectamine^TM 2000进行共转染293T细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养72h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液进行浓缩得到高滴度的慢病毒浓缩液，并通过荧光显微镜或FACS计数荧光细胞，结合稀释倍数计算病毒滴度；

(2)慢病毒颗粒感染A549细胞：感染细胞前，进行细胞复苏及培养，用胰酶消化处于生长对数期的A549细胞，用无抗生素的培养基重悬细胞，并进行细胞计数；

(3)hsa-miR-130b-3p过表达稳转细胞筛选和鉴定：A549细胞经慢病毒转染后，进行2周G418杀伤曲线检测，确定A549的G418筛选浓度为500μg/ml，挑取克隆，使用酶滴消化为单细胞并用96孔板进行单细胞接种，使用荧光观察GFP表达，挑选有荧光的孔，进行细胞扩增，筛选结束后通过荧光定量PCR检测miR-130b，较A549细胞表达提高5倍，干扰效率达到预期，hsa-miR-130b-3p过表达稳转细胞株构建成功。

3.根据权利要求2所述的一种hsa-miR-130b过表达的A549稳转细胞株的构建方法，其特征在于，在步骤(2)中，转染前一天对细胞株进行传代，使其融合度为30％-50％，转染时使用RPMI-1640培养基。