[发明专利]鉴定人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞的方法、探针和试剂盒及其用途

说明书

本发明涉及鉴定和筛选人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞的方法、相关检测剂组合和试剂盒以及相关应用。本发明以单细胞分辨率对人类胚胎BM有核细胞(BMNC)进行了全面筛查，使用两种互补策略(STRT和10X基因组学)进行scRNA‑seq分析，鉴定出LIFR⁺PDGFRB⁺是MSC的特异性标志物。本发明还发现LIFR⁺PDGFRB⁺CD45^‑CD31^‑CD235a^‑MSC可以在体内有效地重建造血微环境。本发明还鉴定了表达TM4SF1⁺CD44⁺CD73⁺CD45^‑CD31^‑CD235a^‑的单能骨祖细胞亚群，其具有成骨潜力。因此，本发明鉴定了两种类型的人类胚胎骨髓MSC，本发明将加深对人类胚胎骨髓来源的MSC的认识以及进一步促进对MSC临床应用的理解。

技术领域

本发明涉及生物领域，并具体涉及一种在单细胞分辨率上通过单细胞转录组学和功能分析从分子和功能上鉴定人类胚胎骨髓来源的间充质干细胞的方法。

背景技术

长期以来，骨髓(bone marrow，BM)来源的间充质干细胞(mesenchymal stromal/stem cell，MSC)一直被描述为可以自我更新并产生基质、骨、软骨和脂肪的细胞类群^1-5。然而，过去对MSC的认识主要集中于体外研究，其在体内的真实身份至今尚未完全明确。使用基因编辑小鼠的几项研究表明，小鼠BM中的LepR⁺、Nestin⁺和Grem1⁺基质细胞，除了具有MSC活性外，还是造血干细胞HSC微环境的重要组分，具有支持HSC的功能^6-8。尽管在过去几十年中通过转基因小鼠已经扩展了我们对MSC的认识，但由于材料限制，目前对人类BM中不同MSC亚群的了解仍然有限⁹。

最近，Huelsken的研究小组发现，小鼠BM原代MSC移植后可在体内重建骨髓基质功能，而这些细胞在体外培养2周后再进行移植，则不再具备重建骨髓基质的功能¹⁰。另有研究表明，体外培养会显著减少MSC在骨髓和脾脏的归巢¹¹。据报道，CD146可标记人骨髓MSC，然而，当把CD146⁺细胞在体外进行培养时，CD146表达水平则会发生显著变化^13，14。此外，原代MSC在体外扩增后，细胞的DNA甲基化也会发生显著差异¹⁵。所有这些研究都清楚地表明，MSC的体外特征并不能真实地反映其体内功能。然而，目前对人类骨髓MSC的了解主要是通过体外培养系统来实现的。因此，鉴定人类骨髓MSC体内真实身份的策略将对以MSC为基础的临床转化应用提供很大的帮助。

单细胞RNA测序(single-cell RNA-sequencing，scRNA-seq)技术的最新突破使得研究人员能够以单细胞分辨率研究新鲜分离的原代细胞，并研究人类MSC在体内的真实身份¹⁶。另一方面，基于每个细胞的转录组，研究人员可以更好地了解不同MSC类群的复杂性和异质性¹⁷。

发明内容

在本研究中，本发明人以单细胞分辨率对人类胚胎BM有核细胞(BMNC)进行了全面筛查(图1a)。本发明人对来源于46个发育周为6周到24周的人类胚胎的原代BMNC，使用两种互补策略(STRT和10X基因组学)进行scRNA-seq分析，以平衡数据准确性。基于系统的生物信息学分析和实验验证，本发明人鉴定了两种类型的人类胚胎骨髓来源的MSC。本发明将加深对人类胚胎骨髓来源的MSC的认识以及进一步促进对MSC临床应用的理解。