[发明专利]一种表面展示β-半乳糖苷酶的重组毕赤酵母及构建方法和应用

说明书

本发明公开一种表面展示β‑半乳糖苷酶的重组毕赤酵母，通过在原始毕赤酵母中异源表达来源于米曲霉BK03的β‑半乳糖苷酶基因lacA与来源于酿酒酵母的细胞壁蛋白pir1p得到。所得的重组菌株GS115‑pir1p‑lacA通过锚定蛋白将β‑半乳糖苷酶基因lacA锚定在细胞表面，固定化后的酶可以用做全细胞催化剂，且重组表面展示菌株能一直保持较高的酶活力，酶活能持续较久，随着菌的存活一直稳定存在。

技术领域

涉及酶的基因工程领域，具体涉及一种细胞表面展示来源于米曲霉的β-半乳糖苷酶lacA的重组毕赤酵母菌株的构建方法和应用。

背景技术

微生物表面展示技术是伴随着基因工程的发展而兴起的重要的生物技术之一，酵母表面展示体系是继噬菌体展示体系和细菌表面展示体系之后发展迅速的一种外源蛋白表达体系。酵母是具有细胞壁的单细胞真核生物，酵母表面展示技术的基本原理是以细胞表面的蛋白(通常是细胞壁外层的甘露糖蛋白)作为锚定蛋白，通过基因工程手段，将编码外源蛋白或多肽的基因序列与编码特定的锚定蛋白的基因序列融合后导入酵母中，从而使外源蛋白或多肽与锚定蛋白以融合蛋白的形式展示在酵母细胞的表面，被展示的外源蛋白或多肽可保持相对独立的空间结构和生物活性，并可使表达、纯化、固定于一体，从而省去提取纯化的繁琐工序。酵母表面展示体系有其独特的优势，主要表现在以下几个方面：

(1)通常作为锚定蛋白的细胞壁蛋白可通过共价键连接到细胞壁内层葡聚糖骨架上，从而使外源蛋白牢固的展示在酵母细胞的表面；

(2)酵母作为真核生物，拥有比较完善的蛋白质折叠和分泌机制，因此可用来表达需要进行翻译后修饰的来自真核生物的蛋白；

(3)酵母是单细胞生物，颗粒相对比较大，可通过流式细胞术对展示有目标外源蛋白的细胞进行方便的筛选和分离。

酵母细胞表面展示体系已经广泛应用在生物学研究及工业生产的许多领域。毕赤酵母细胞表面展示体系是近年来发展迅速且应用广泛的一种真核表达体系，运用毕赤酵母细胞表面展示体系展示各种酶作为全细胞催化剂，不仅具有固定化酶的特性及优点，而且制备方法简单，易于回收与再生利用，因此具有广阔的应用前景。现有技术中尚未有在细胞表面展示来源于米曲霉的β-半乳糖苷酶lacA的重组毕赤酵母菌株的构建的报导。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种毕赤酵母表面展示菌株，提高酶的重复利用次数，可使表达、纯化、固定化于一体，省去繁杂的提取纯化步骤。

本发明还要解决的技术问题是提供上述表面展示β-半乳糖苷酶lacA的重组毕赤酵母菌株的构建方法。

本发明进一步要解决的技术问题是提供上述表面展示β-半乳糖苷酶lacA的重组毕赤酵母菌株的应用。

本发明旨在采用毕赤酵母表面展示技术将来自米曲霉Aspergillus oryzae BK03的β-半乳糖苷酶基因lacA展示表达在毕赤酵母Pichia pastoris GS115细胞表面，获得一株能合成低聚半乳糖的重组菌株，并对该菌株进一步研究。通过分子生物学的方法，将细胞壁锚定蛋白基因Pir1p和β-半乳糖苷酶基因lacA先进行overlap,然后克隆到pPIC9k质粒中(其中lacA基因终止密码子之前带有FLAG标签，Pir1p和lacA基因之间加一个Linker，同时Pir1p和lacA的信号肽也均被去除)，再将线性化质粒通过电转到毕赤酵母的基因组中。通过重组菌株固定化细胞固定化酶的研究，测定酶活和产量变化，获得一株高产低聚半乳糖的表面展示菌株。

为实现上述目的，本发明公开了一种表面展示β-半乳糖苷酶的重组毕赤酵母，通过在原始毕赤酵母中异源表达来源于米曲霉BK03的β-半乳糖苷酶基因lacA与来源于酿酒酵母的细胞壁蛋白基因pir1p得到。

其中，所述原始毕赤酵母为Pichia pastoris GS115。