[发明专利]一种表面展示β-半乳糖苷酶的重组毕赤酵母及构建方法和应用有效

专利信息
申请号: 202210456408.4 申请日: 2022-04-27
公开(公告)号: CN114606151B 公开(公告)日: 2023-05-19
发明(设计)人: 应汉杰;王诗萌;陈勇;陈天鹏;牛欢青;孙文俊;余斌;柳东;欧阳平凯 申请(专利权)人: 南京工业大学
主分类号: C12N1/19 分类号: C12N1/19;C12N15/56;C12N15/62;C12N15/81;C12P19/04;C12R1/84
代理公司: 江苏圣典律师事务所 32237 代理人: 肖明芳
地址: 211800 江*** 国省代码: 江苏;32
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摘要:
搜索关键词: 一种 表面 展示 半乳糖 重组 酵母 构建 方法 应用
【权利要求书】:

1.一种表面展示β-半乳糖苷酶的重组毕赤酵母,其特征在于,通过在原始毕赤酵母中异源表达来源于米曲霉BK03的β-半乳糖苷酶基因lacA与来源于酿酒酵母的细胞壁蛋白基因pir1p得到,所述来源于米曲霉BK03的β-半乳糖苷酶基因lacA的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示;所述来源于酿酒酵母的细胞壁蛋白基因pir1p的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的重组毕赤酵母,其特征在于,所述原始毕赤酵母为Pichia pastoris GS115

3.权利要求1或2所述的重组毕赤酵母的构建方法,其特征在于,将来源于酿酒酵母的细胞壁蛋白pir1p和来源于米曲霉BK03的β-半乳糖苷酶基因lacA先进行重叠,然后克隆到pPIC9k质粒中,得到线性化质粒,然后将所述线性化质粒通过电转化导入毕赤酵母的基因组中。

4.权利要求1或2所述的重组毕赤酵母的诱导表达方法,其特征在于,将所述重组毕赤酵母接种于YPD液体培养基,过夜培养得到种子液,然后将种子液接种于BMGY培养基中培养,培养至OD600达到2-6,取BMGY培养基离心去上清,将得到的菌体沉淀用无菌水洗涤,然后将沉淀转移至含有甲醇的BMMY培养基中于继续培养。

5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述YPD液体培养基包括10 g/L酵母粉、20g/L蛋白胨和20 g/L葡萄糖;所述BMGY培养基包含10 g/L酵母粉、20 g/L蛋白胨、2 ml/L生物素母液、100 ml/L 10%甘油、100 ml/L 磷酸钾母液和100 ml/L YNB母液。

6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,YNB母液由20.1g YNB和150 ml H2O组成,磷酸钾母液由0.45g K2HPO4、1.77g KH2PO和150 ml H2O组成,生物素母液由20mg和100mlH2O组成。

7.权利要求1或2所述的重组毕赤酵母在发酵产低聚半乳糖中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,将所述重组毕赤酵母接种于毕赤酵母发酵培养基BMMY中发酵培养,离心收集菌体,然后以乳糖为底物进行细胞转化,得到低聚半乳糖。

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