[发明专利]一种用于棘头梅童鱼SSR多重PCR引物及其应用

说明书

本发明公开了一种用于棘头梅童鱼SSR多重PCR引物，所述SSR多重PCR引物包括9对特异性引物，分别为引物对Clu982、Clu1605、Clu740、Clu493、Clu1563、Clu873、Clu1288、Clu1020和Clu370，其中每对引物包括一个正向引物和一个反向引物，所述9对特异性引物的碱基序列依序分别如SEQ ID NO：1～18所示。还公开了包括这些引物的试剂盒，以及棘头梅童鱼微卫星荧光多重PCR的方法。和上述引物、试剂盒以及方法在在评估棘头梅童鱼遗传多样性方面的应用。

技术领域

本发明属于微卫星标记技术领域，具体涉及一种用于棘头梅童鱼SSR多重PCR引物及其应用。

背景技术

棘头梅童鱼(Collichthys lucidus)隶属鲈形目(Perciformes)、石首鱼科(Sciaendae)、梅童鱼属(Collichthys)，分布于西太平洋区，包括菲律宾、越南、中国、朝鲜、韩国及日本等沿海水域，是这些国家的主要经济鱼类之一，在我国主要分布在黄海和东海，以东海产量最大。据1986年的定点调查，珠江口棘头梅童鱼的渔获量在定置作业中占渔获组成的24％，在底拖网渔业种占渔获组成的26％(何宝全李辉权,1988)。从上世界70年代开始，我国的海洋渔业资源受到了过度捕捞，表现在群体营养级降低、个体小型化低龄化。对2018—2019的珠江口监测数据分析显示，棘头梅童鱼的初次性成熟年龄从1986—1987年体长112mm缩短至2018—2019的88mm，表现出来过度捕捞的特征(赖丽华et al.,2022；熊朋莉et al.,2021)。棘头梅童鱼具有肉质幼嫩、肉味鲜美，经济价值高的特征，近年已作为了水产养殖对象进行人工驯养。人类活动对棘头梅童鱼群体的干扰催生了对其遗传多样性的长期监测需求。目前常用的分子标记有单核苷酸多态性(SNP)和微卫星标记(SSR)，如ZhaoLinlin等开发了169624个SNP标记(Zhao et al.,2017)，Ma Chunyan等开发了19个SSR标记(Ma et al.,2011)。长期监测工具需要具有稳定性和低成本的要求，多重PCR-SSR标记是目前最为适合的技术，但是需要进一步在获得的SSR标记基础上进行筛选。

本发明拟在筛选全基因组简单重复序列的基础上，开发基序为3-6碱基的多重PCR-SSR标记。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于棘头梅童鱼SSR多重PCR引物以及包括这些引物的试剂盒，这些引物多态性高，扩增稳定，结果可靠。

本发明的目的还在于提供一种棘头梅童鱼微卫星荧光多重PCR的方法。

本发明的最后一个目的在于提供上述引物、试剂盒以及方法在在评估棘头梅童鱼遗传多样性方面的应用。

本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现的：一种用于棘头梅童鱼SSR多重PCR引物，所述SSR多重PCR引物包括9对特异性引物，分别为引物对Clu982、Clu1605、Clu740、Clu493、Clu1563、Clu873、Clu1288、Clu1020和Clu370，其中每对引物包括一个正向引物和一个反向引物，所述9对特异性引物的碱基序列依序分别如SEQ ID NO：1～18所示。

进一步的，还包括两条荧光标记通用引物M13和PQE-F，与所述通用引物M13相配合的荧光标记为5-FAM，与所述通用引物PQE-F相配合的荧光标记为5-HEX，其中所述通用引物M13、PQE-F的碱基序列分别如SEQ ID NO：19～20所示。

本发明还提供了一种用于棘头梅童鱼SSR多重PCR的试剂盒，包括所述9对特异性引物。

本发明还进一步提供了一种用于棘头梅童鱼SSR多重PCR的试剂盒，包括所述9对特异性引物以及所述荧光标记通用引物。

本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种棘头梅童鱼微卫星荧光多重PCR的方法，包括以下步骤：