[发明专利]一种微液滴数字PCR液滴检测方法及系统

说明书

本发明公开了一种微液滴数字PCR液滴检测方法及系统，包括：获取微液滴数字PCR图像并进行预处理，在预处理后的图像上依次使用Canny边缘检测和Hough圆检测获取独立液滴的定位信息，按定位信息对液滴进行截取并进行人工标注，以构建训练数据集；基于卷积神经网络构建液滴识别模型，使用训练数据集进行训练；将待测微液滴数字PCR图像进行预处理，使用Canny边缘检测和Hough圆检测获取独立液滴的定位信息，获得每个液滴的图像并按批次输入训练好的液滴识别模型，对液滴进行有效或无效分类识别；最后根据有效液滴的中心灰度进行阴性阳性判断。本发明的方法及系统可对样本中的阳性微液滴进行高精准度、高通量地识别。

技术领域

本发明涉及核酸检测分析技术领域，尤其涉及一种微液滴数字PCR液滴检测方法及系统。

背景技术

微液滴数字PCR(droplet digital polymerase chain reaction, ddPCR)是一种单分子水平的核酸定量分析技术，在精准医学和临床诊断中有着广泛的应用。借助液滴微流控技术，ddPCR将传统的PCR反应混合溶液分成数万个纳升级别的微液滴(每个微液滴作为一个独立的反应单元，其中包含0或1个核酸分子)，含有目标核酸分子的液滴在PCR扩增后会呈现出较强的荧光信号。通过荧光检测，根据荧光强度对微液滴进行阴性或阳性的分类和计数，即可判断出含有目标核酸分子的液滴数量和比例。最后，根据阳性微液滴个数和统计学分析(泊松分布原理)，对检测样本中的目标核酸分子的进行绝对定量检测。

在上述过程中，微液滴数字PCR的液滴数据分类是关键步骤(通常包括图像预处理、液滴分割和液滴分类三个部分)，它直接影响到统计学计算的输入，因而决定着ddPCR的定量结果准确性。

图像预处理中滤波是不可或缺的步骤，通过抑制或消除图像的噪声，提高图像的信噪比，来改善图像特征的识别和信号的提取。由于数字PCR反应结果是通过微弱荧光成像的方式得到的，所以杂光、杂点的引入是难以避免的。由于液滴数据的分类以单个反应单元为单位实现定位和分类，所以，一旦反应单元中出现杂点，检测结果的准确性会受到严重影响。常用的滤波方法包括中值滤波、高斯滤波、双边滤波等滤波算法。但上述滤波方法只能对微小的简单荧光斑点进行滤除，对于杂光、杂点、无效液滴以及支撑柱等干扰，只能通过规整的芯片设计避免光斑干扰，或通过手动方法进行人工剔除。

ddPCR数据的分割分类方法，目前主要有两种：手动阈值法和自动分类算法。其中最常用的是手动阈值法，即针对每种反应，根据阴性和阳性液滴荧光强度的平均信号，观察得到各类数据的分界线，然后通过手动设置阈值或封闭曲线的方式对 ddPCR 数据进行液滴分割和分类。但实验人员和实验批次等因素的不同，会直接影响手动阈值法的判定结果，导致检测系统不稳。

自动分割分类算法包含有监督和无监督两类分类算法。总的来说，有监督方法具有较高的准确性，但是针对不同的样本类型和检测指标，需要开发多种不同的分类算法。无监督方法，虽然不用训练数据就可以自动对样本进行分割分类，但是它们的准确性和可靠性通常都不尽如人意，时常会出现假阴性和假阳性的检测结果。