[发明专利]用于双通道FRET成像的相机安装装置及其校正方法

说明书

用于双通道FRET成像的相机安装装置，包括分光模块、透射光成像相机支架模块和反射光成像相机四轴可调支架模块；校正方法包括如下步骤：首先将用于双通道定量FRET成像的四轴可调的光学相机安装装置连接到荧光显微镜的成像相机安装接口处，然后固定透射光成像相机，再对准双相机焦面，最后校准反射光成像相机旋转角度误差和x、y方向的平移误差。本发明的装置和方法可以对用于双通道定量FRET成像的两个相机进行像素级精准匹配，保证了双通道定量FRET成像检测结果的准确性，完整地保留了整个成像区域，避免了软件校准对原图进行裁切导致可用于后续处理的图像区域变小的问题，属于光学成像技术领域。

技术领域

本发明涉及光学成像技术领域，具体涉及用于双通道FRET成像的相机安装装置及其校正方法。

背景技术

荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)是当两个荧光基团满足适当的光谱重叠和距离要求时，能量从激发态的供体荧光团通过偶极间的耦合转到基态受体荧光团的一种非辐射能量转移过程。能量转移的效率E与两个荧光基团之间空间距离R的六次方成反比，因此对空间距离极其敏感。其表达式为：

其中R₀是效率E为50％时供体荧光基团和受体荧光基团之间的空间距离。FRET作用的典型范围为1-10nm，正好是生物大分子事件的空间尺度，因此FRET显微术被称为“光谱纳米分子尺”，在研究蛋白质相互作用、大分子构象变化和信号通路中蛋白间的调节机制等方面得到了广泛的应用。

为了使得不同实验室得到的FRET数据可以定量评估、比较，促进实验室之间的交流与合作，FRET定量检测是必要的。“3-cubes FRET”荧光显微术(E-FRET)因其快速、简单、无损等特性被认为是最适合于活细胞动态定量FRET监测的定量FRET检测方法。完成一次E-FRET检测需要对同一个视野进行三次成像，采集供体激发供体发射图像(I_DD)、供体激发受体发射图像(I_DA)和受体激发受体发射图像(I_AA)。通过双通道成像的方式在供体激发光激发样本时同时采集I_DD图像和I_DA图像可以减少细胞运动引起的测量误差，提升采集速度。E-FRET方法通过对I_DD、I_DA和I_AA图像进行逐像素计算来获得FRET效率值，三个图像须尽可能保证是相同视野的相同焦面的图像。因此，通过双通道成像完成E-FRET检测时必须要对两个成像通道进行校正，保证两个通道的像素级的匹配。Sun等人设计了自动双通道E-FRET显微镜。该系统通过在双通道校准界面下输入混合误差值完成失配校正。混合误差值通过将两个相机拍摄的千分尺图像“4”加载到HCImageLive软件中，对两张图像手动调整错位进行图像叠加和逐像素匹配来获得。然而，该系统并没有从硬件上解决两个成像通道的偏差，若硬件偏差较大将大大减小校正后的图像可用的视野区域。此外，该系统未考虑对两个通道不在同一焦面的情况的校正，因此势必会影响逐像素计算得到的FRET效率的准确性。是否获取了目标的清晰图像对于能否准确地测量目标以及能否准确计算FRET效率至关重要。相机在不同的成像焦面所捕获的图像的清晰度是不同的，清晰度通常用清晰度评价函数来量化。根据实现原理的不同，清晰度函数可分为空域清晰度评价函数、频域评价函数和信息学类评价函数。空域类清晰度评价函数由于其原理简单、效率高和稳定性好等优点受到了广泛的关注。熊等人在经典空域评价函数Brenner函数和Roberts函数的基础上将两者结合提出了Brenner2d_Roberts函数，该函数相较于传统函数在显微图像上表现出了较好的稳定性和灵敏度。然而，该函数在±45度方向上的梯度运算仅考虑2*2的像素区域的梯度，且在x和y方向计算梯度时未取绝对值，灵敏度有待提高；此外，该函数以1为步长统计整幅图像的梯度和，计算量较大，实时性有待提高。

发明内容

针对现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是：提供一种可方便地对两个通道进行误差校正的用于双通道定量FRET成像的相机安装装置及其校正方法。