[发明专利]一种病毒穿梭质粒及其用途

说明书

本发明涉及一种病毒穿梭质粒及其用途，该病毒穿梭质粒在5’端到3’端之间包括插入片段，所述插入片段包括Lac操纵子来源的lac启动子、氯霉素抗性基因Cmr和致死基因ccdB。该病毒穿梭质粒能够用作病毒穿梭质粒通用型骨架使用，能有效地提高阳性克隆率，使筛选阳性克隆不需要特殊试剂，操作简单，节省大量时间和阳性克隆筛选成本，并且降低了产生假阳性或者假阴性结果的概率。

技术领域

本发明涉及基因工程和分子生物学领域，尤其涉及一种病毒穿梭质粒及其用途。

背景技术

基因克隆技术，又称重组 DNA 技术，是将目的基因与具有自主复制能力的载体DNA 进行体外重组，获得新的重组DNA后导入受体细胞中表达相应蛋白，以研究蛋白结构与功能及其与其他分子的相互作用。

20世纪70年代初创建的经典基因克隆技术，利用限制性内切酶能识别并酶切特异DNA序列的特性，使目的DNA片段和载体产生平末端或粘性末端，然后在DNA连接酶的作用下，将酶切后的目的DNA片段和载体连接成重组DNA分子。后续通过菌落PCR、质粒酶切、测序等方法进行筛选和鉴定。

无缝克隆技术在引物设计及目的DNA片段的扩增阶段，与常规PCR法是相同的，和经典基因克隆技术的差异在于载体末端和引物末端应具有 15～20 个同源碱基，由此得到的 PCR 产物两端便分别带上了 15～20 个与载体序列同源性的碱基，通过相关酶试剂处理，同时除去载体与目的DNA上同源片段的双链中的一条链，这样载体和目的DNA两端就露出了能够互补配对的序列，依靠同源序列碱基间的配对能使载体和目的DNA较为紧密的连在一起而无需酶联，直接用于转化；无缝克隆技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行插入一个或多个目的基因，大大提高了工作效率。

虽然在技术上越来越便捷，但筛选阳性克隆却是一件繁琐、费时的工作。

因此，仍然迫切需要操作简单，节省时间和成本，阳性克隆筛选率高的筛选阳性克隆的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种高阳性克隆率的病毒穿梭质粒及其用途，该病毒穿梭质粒能够用作病毒穿梭质粒通用型骨架使用，能有效地提高阳性克隆率，使筛选阳性克隆不需要特殊试剂，操作简单，节省大量时间和阳性克隆筛选成本，并且降低了产生假阳性或者假阴性结果的概率。

基于上述目的，本发明的第一个方面提供了一种病毒穿梭质粒，其在5’端到3’端之间包括插入片段，所述插入片段包括Lac操纵子来源的lac启动子、氯霉素抗性基因Cmr和致死基因ccdB。

在本发明的优选实施方案中，所述插入片段的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。

在本发明的优选实施方案中，所述病毒穿梭质粒可以为腺病毒穿梭质粒、腺相关病毒穿梭质粒或逆转录病毒穿梭质粒。

在本发明的优选实施方案中，所述逆转录病毒穿梭质粒可以为慢病毒穿梭质粒。

在本发明的优选实施方案中，所述慢病毒穿梭质粒自5’端到3’端还包括：

---5’LTR；

---Psi(ψ)包装信号（HIV-1 Ψ）；

---输出元件（RRE）；

---中央多聚嘌呤区/中央终止序列（cPPT/CTS）；

---CMV增强子（CMV enhancer）

---与插入片段可操作地连接的启动子（CMV Promoter）；

---转录后调控元件（WPRE）；

---猿猴病毒40启动子（SV40启动子）；

---杀稻瘟菌素（BSD）；

---3’LTR。