[发明专利]一种病毒穿梭质粒及其用途

权利要求书

1.一种病毒穿梭质粒，其在5’端到3’端之间包括插入片段，所述插入片段包括Lac操纵子来源的lac启动子、氯霉素抗性基因Cmr和致死基因ccdB。

2.根据权利要求1所述的病毒穿梭质粒，其中，所述插入片段的核苷酸序列如SEQ IDNO: 1所示。

3.根据权利要求1或2所述的病毒穿梭质粒，其为腺病毒穿梭质粒、腺相关病毒穿梭质粒或逆转录病毒穿梭质粒。

4.根据权利要求3所述的病毒穿梭质粒，其为慢病毒穿梭质粒。

5.根据权利要求4所述的病毒穿梭质粒，其自5’端到3’端还包括：

5’LTR；

Psi(ψ)包装信号；

输出元件；

中央多聚嘌呤区/中央终止序列；

CMV增强子;

与插入片段可操作地连接的启动子；

转录后调控元件；

猿猴病毒40启动子；

杀稻瘟菌素；

3’LTR。

6.根据权利要求5所述的病毒穿梭质粒，其中，在3’LTR之后还包括：猿猴病毒40转录终止位点、猿猴病毒40复制起始位点、f1噬菌体复制起始位点、氨苄启动子、氨苄抗性基因和大肠杆菌复制起始位点。

7.根据权利要求5所述的病毒穿梭质粒，其中，在5’LTR之前还包括劳斯肉瘤病毒启动子。

8.根据权利要求5所述的病毒穿梭质粒，其中，所述与插入片段可操作地连接的启动子包括CMV启动子。

9.根据权利要求5所述的病毒穿梭质粒，其中，所述3’LTR为3’自身失活的长末端重复序列。

10.根据权利要求5所述的病毒穿梭质粒，其中，所述输出元件包括Rev响应元件。

11.根据权利要求5所述的病毒穿梭质粒，其中，所述转录后调控元件包括土拨鼠肝炎转录后修饰调控元件。

12.根据权利要求5所述的病毒穿梭质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。

13.一种提高阳性克隆率的方法，其包括以下步骤：

1) 酶切权利要求1-12中任一项所述的病毒穿梭质粒以去除Lac操纵子来源的lac启动子、氯霉素抗性基因Cmr和致死基因ccdB；

2) 将目的片段与去除Lac操纵子来源的lac启动子、氯霉素抗性基因Cmr和致死基因ccdB后的病毒穿梭质粒重组连接，然后转化细胞；

3) 筛选存活的细胞，从而得到带有目的片段的阳性克隆。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述目的片段为7341，核苷酸序列如SEQ IDNO: 10所示。

15.根据权利要求13或14所述的方法，其中，所述细胞为大肠杆菌Stbl3感受态细胞。