[发明专利]一种营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体构建方法

说明书

本发明公开一种营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体构建方法，包括步骤一、以野生型拟轮枝镰孢菌为出发菌制备原生质体，步骤二、向原生质体中导入拟轮枝镰孢菌尿嘧啶合成路径关键基因pyrG的上下游同源臂和CRISPR/Cas9载体，步骤三、敲除pyrG基因的全部序列得到尿嘧啶营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体ΔFvpyrG；本发明以尿嘧啶营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体为出发菌，对伏马菌素合成路径的关键基因FUM1进行敲除，实现了pyrG筛选标记在拟轮枝镰孢菌中的循环利用，对植物病原真菌拟轮枝镰孢菌的基因功能研究以及应用开发具有重要的意义。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体构建方法。

背景技术

拟轮枝镰孢菌是一种重要的植物病原真菌，可侵染玉米、高粱、小麦等多种作物。拟轮枝镰孢菌引起的玉米茎穗腐病以及真菌毒素污染是玉米产业健康发展的一大限制因素，其产生的伏马毒素FB1和FB2等均被世界卫生组织国际癌症研究机构列为2B类致癌物，因此对拟轮枝镰孢菌进行基因功能研究以寻找药物靶标来开发农药具有重要的经济意义。

传统的丝状真菌遗传转化中所使用的尿嘧啶营养缺陷型菌株主要依靠紫外诱变等方法获得，但是该方法得到的尿嘧啶营养缺陷型菌株残留相关基因片段，且可能带有未知表型的其他突变，对后续在该菌株基础上进行基因改造和功能研究存在一定的隐患，因此，本发明提出一种营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体构建方法以解决现有技术中存在的问题。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提出一种营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体构建方法，该营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体构建方法通过具有剪切功能的Cas9蛋白以及具有识别功能的sgRNA，即可实现对特异性靶标位点的剪切，诱发生物体内的自我修复机制，在导入同源片段的情况下，实现基因序列的完全敲除。

为实现本发明的目的，本发明通过以下技术方案实现：一种营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体构建方法，包括以下步骤：

步骤一、以野生型拟轮枝镰孢菌为出发菌制备得到原生质体；

步骤二、向步骤一中制备的原生质体导入拟轮枝镰孢菌尿嘧啶合成路径关键基因pyrG的上下游同源臂和靶向pyrG基因前端位点的CRISPR/Cas9载体PFC332_pyrG_sgRNA-7G；

步骤三、将pyrG基因的上游-53bp至下游+107bp共1754bp序列完全敲除，得到尿嘧啶营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体ΔFvpyrG。

进一步改进在于：所述步骤二中的pyrG的上下游同源臂为pyrG基因的上游1201bp片段和下游1202bp片段的融合片段，其中上游1201bp片段为-1254bp到-54bp之间的片段，下游1202bp片段为+108bp到+1309bp之间的片段。

进一步改进在于：所述步骤二中靶向pyrG基因前端位点的CRISPR/Cas9载体为PFC332_pyrG_sgRNA-7G，所述CRISPR/Cas9载体PFC332_pyrG_sgRNA-7G靶向的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体构建方法构建的营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体在基因敲除中的应用。

本发明的有益效果为：本发明以尿嘧啶营养缺陷型拟轮枝镰孢菌为出发菌，对伏马菌素合成路径的关键基因FUM1进行敲除，实现了pyrG筛选标记在拟轮枝镰孢菌中的循环利用，对植物病原真菌拟轮枝镰孢菌的基因功能研究以及应用开发具有重要的意义。

附图说明

图1为本发明实施例一拟轮枝镰孢菌突变体构建流程图。

图2为本发明实施例一基因敲除中的应用流程图。

图3为本发明实施例一含有pyrG筛选标记基因的FUM1上下游同源片段构建流程图。