[发明专利]一种PSGL-1人源化非人类动物模型的构建方法及应用

说明书

本发明公开了一种PSGL‑1人源化非人类动物模型的构建方法及应用。本发明利用CRISPR/Cas9技术，在非人类动物的Rosa26loci位点定点敲入人PSGL‑1基因，构建可以表达人源PSGL‑1的非人类动物模型。通过相关实验，分别在核酸水平和蛋白水平上说明本发明成功构建了人源化PSGL‑1非人类动物模型。利用该非人类动物模型可进行人PSGL‑1蛋白在炎症相关疾病发病过程中的研究，并实现人源化PSGL‑1抗体药物的安全性和有效性评价。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体而言，本发明涉及一种PSGL-1人源化非人 类动物模型的构建方法及应用。

背景技术

白细胞束缚和滚动是炎症反应发生的起始步骤，体内发炎血管的束缚和滚 动主要是由选择素(selectin)介导的。而P-选择蛋白糖蛋白配体-1(PSGL-1) 是一种持续表达在所有白细胞(包括单核细胞，粒细胞，淋巴细胞某些CD34+ 干细胞)表面的，能够和选择素结合的二聚体型，粘蛋白型糖蛋白配体。选择 素有三个亚型，包括P-selectin,E-selectin和L-selectin,其中P-selectin表达于激 活的血小板和血管内皮细胞表面，E-selectin表达于激活的内皮细胞表面，L- selectin表达于大部分白细胞表面。PSGL-1能与三种选择素结合，但是与P- selectin结合能力最强。PSGL-1与激活的血管内皮表面P-selectin/E-selectin结合 之后启动白细胞与血管内皮的粘附和滚动，促进白细胞向内膜下的浸润，促进 炎症因子的分泌；PSGL-1与活化的血小板表面的P-selectin结合，导致白细胞- 血小板复合体的形成，进一步促进炎症细胞的粘附和浸润；PSGL-1与T细胞表 面的L-selectin的结合能调节T细胞的归巢，促进后续炎症因子的分泌。

人PSGL-1蛋白的结构包括结合区，跨膜区和胞质区(PSGL-1 as a noveltherapeutic target.Constantin G.Drug News Perspect 2004)。粘蛋白在其上形成二硫键结合的同二聚体。人PSGL-1富含丝氨酸，苏氨酸和脯氨酸，并包含15个 十聚体重复序列。残基46、48和51的三个NH₂末端酪氨酸位于有利于酪氨酸 硫酸化的阴离子共有序列中。潜在的O-连接的糖基化位点存在于苏氨酸44、57、 69和70中。P-选择素通过与聚簇的酪氨酸硫酸盐和附近的核心2O-聚糖与唾液 酸化的Lewis x(sLex)表位立体定向相互作用，与PSGL-1的N末端结合。类 似地，L-选择蛋白通过与三个硫酸化酪氨酸残基和适当定位的C2-O-sLex O-聚 糖的协同相互作用，以高亲和力与PSGL-1的N末端区域结合。E-选择蛋白-PSGL-1的结合似乎不依赖于硫酸盐化，需要岩藻糖基转移酶使sLex和PSGL-1 糖基化。越来越多的研究表明，PSGL-1和炎症性疾病的发生发展密切相关，如 胰腺炎、结肠炎、缺血再灌注损伤、血栓、动脉粥样硬化等。PSGL-1在炎症相 关疾病中发挥重要作用。

目前已经研发出多个针对人PSGL-1基因靶点的抗体，如Neihulizumab和 SelK-2。然而，由于人PSGL-1基因与动物PSGL-1基因同源性低，存在较大的 差异。这些针对人PSGL-1基因靶点的抗体或者药物并不能识别动物PSGL-1基 因靶点，导致无法用普通野生型动物评价这类抗体的有效性及安全性。故需对 野生型动物的PSGL-1基因进行人源化改造，使其含有人PSGL-1基因，并表达 人PSGL-1蛋白，用于评价抗体或药物的体内有效性及安全性。

发明内容

大多数关于PSGL-1的研究都是基于PSGL-1敲除的非人类动物模型，尚未 见人源化PSGL-1非人类动物模型报道。本发明的目的是提供一种hPSGL-1人 源化非人类动物模型及其构建方法，利用该人源化非人类动物模型可进行人 PSGL-1蛋白在炎症相关疾病发病过程中的研究，并实现人源化PSGL-1抗体药 物的安全性和有效性评价。本发明提供了一种敲入人PSGL-1基因的方式，构建 可以表达人源PSGL-1的非人类动物模型，对实现其它人源基因的定点敲入亦有 参考价值。