[发明专利]一种生物合成NMN的方法

说明书

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种重组大肠杆菌生物合成NMN的方法。所述工程菌是在大肠杆菌宿主中，通过缺失对烟酰胺核苷酸酰胺酶编码基因pncC、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶基因nadD、nadR的表达的同时，过表达NADsupgt;+/supgt;合酶编码基因nadE；表达烟酸磷酸核糖转移酶突变体编码基因NadVsubgt;mu/subgt;、核糖磷酸二磷酸激酶编码基因Prs以及核糖激酶编码基因RbsK获得的；本发明同时对NadV进行了定向进化，使催化效率达到最佳。本发明采用上述重组菌全细胞为催化剂催化转化，方法简单；反应底物为烟酰胺和核糖，生产成本较低；建了依赖烟酰胺和核糖的NMN生物合成途径，使相关酶能够高效表达，使NMN产量达到2.88g/L。

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种重组大肠杆菌生物合成NMN的方法。

背景技术：

作为生命体内200多种还原反应的辅酶，NAD是3类NAD消耗酶的底物，在多种细胞的生理过程中起着至关重要的作用，NAD的生物能量状态甚至决定了细胞的生死存亡。同时，NAD的代谢在健康和疾病状态中起着重要作用，逐渐引起人们的关注，因此参与NAD生物合成和代谢的酶也成为了疾病治疗中具有关注热度的药物靶标。

NMN(nicotinamide mononucleotide)，即烟酰胺单核苷酸，是一种自然存在的生物活性核苷酸，NMN作为细胞内参与NAD合成的重要底物，在人体细胞能量生成中扮演重要角色。NMN是人体内原本存在的物质，但随着年龄的增长而减少。在哺乳动物体内，NMN主要由烟酰胺在烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nicotinamide phosphate ribose transferase，Nampt)的催化作用下生成，随后NMN在烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的催化下生成NAD⁺。在细胞外的NMN则需要脱去磷酸转化为烟酰胺核糖(NR)才能进入肝细胞内部，进入胞内后，烟酰胺核糖在烟酰胺核苷激酶的作用下再磷酸化生成NMN，随后NMN和ATP结合生成NAD+。

目前NMN合成主要通过化学催化与酶催化进行。传统的体外制备β-烟酰胺单核苷酸的方法为化学合成法，催化NMN时需要用到危险化学品和大量的有机溶剂，会破坏环境且操作复杂、反应步骤多、中间产物多、得率低、产品纯化困难。比如，Tanimori等人用乙酰基保护的核糖与烟酰胺在TMSOTf的催化下发生缩合反应；又比如Palmarisa等人使用硅烷化试剂对烟酰胺进行硅烷化，然后与乙酰核糖在TMSOTf的催化下进行反应。这些化学合成方法存在成本高、收率低而且化学试剂污染大等问题。

至于酶催化，所需原料ATP比较昂贵，生产NMN的成本很高。早在1994年，Jeck等利用二磷酸吡啶核苷酸为原料，在焦磷酸化酶的催化水解下生成烟酰胺单核苷酸。2016年，深圳邦泰公司利用烟酰胺、ATP和核糖为底物，在烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶以及核糖激酶的催化下生成烟酰胺单核苷酸。2017年，该公司进一步改进工艺，以烟酰胺、焦磷酸或其盐和AMP为原料，在烟酰胺磷酸核糖转移酶和腺膘呤磷酸核糖转移酶的催化作用下发生反应，获得烟酰胺单核苷酸；该工艺优势在于使用磷酸核糖焦磷酸为原料，降低了成本。2018年，尚科生物报道以D-5-磷酸核糖、ATP和烟酰胺为原料，通过固定化含有磷酸核糖焦磷酸合成酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶的活性细胞，实现了高效生物催化合成β-烟酰胺单核苷酸。固定化细胞或固定化酶可以重复多次使用，利于纯化，以降低生产成本，但是合成所需原料ATP相对比较昂贵，也增加了NMN的生产成本。