[发明专利]一种用于诊断部分性性早熟女童的特异性生物标记物及其筛选方法和应用

权利要求书

1.一种用于诊断部分性性早熟女童的特异性生物标记物，其特征在于，所述特异性生物标记物同时包含：

1-甲基组氨酸、肌醇、N,N-二甲基甘氨酸、极低密度脂蛋白、甘油、鸟氨酸、天冬酰胺和甘氨酸。

2.一种组合物在制备用于部分性性早熟女童诊断的诊断试剂中的应用，其特征在于，所述组合物包含血液中生物标记物的检测试剂，所述生物标记物为1-甲基组氨酸、肌醇、N,N-二甲基甘氨酸、极低密度脂蛋白、甘油、鸟氨酸、天冬酰胺和甘氨酸的组合。

3.一种用于诊断部分性性早熟女童的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用来在血液中检测1-甲基组氨酸、肌醇、N,N-二甲基甘氨酸、极低密度脂蛋白、甘油、鸟氨酸、天冬酰胺和甘氨酸的生物标记物，所述试剂盒包含与上述生物标记物中各标记物特异性结合的抗体。

4.根据权利要求3所述的用于诊断部分性性早熟女童的试剂盒，其特征在于，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。

5.根据权利要求3或4所述的用于诊断部分性性早熟女童的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包含：二级抗体结合物，该二级抗体结合物与通过同基质反应而显色的标记物结合；与所述标记物进行显色反应的显色基质溶液；清洗液；以及酶反应终止液。

6.根据权利要求5所述的用于诊断部分性性早熟女童的试剂盒，其特征在于，所述二级抗体结合物选自辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、胶体金、荧光素和染料。

7.一种用于诊断部分性性早熟女童的诊断试剂，其特征在于，所述诊断试剂用于检测血液中1-甲基组氨酸、肌醇、N,N-二甲基甘氨酸、极低密度脂蛋白、甘油、鸟氨酸、天冬酰胺和甘氨酸的生物标记物，该诊断试剂包括与各个所述生物标记物特异性结合的抗体。

8.一种部分性性早熟女童特异性生物标志物的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括如下步骤：

S1.研究队列的纳入标准和血清样本的收集

选自含有性早熟和正常女童(含有青春期前女童PAD，青春期女童AD)的血清样本，采用免疫化学发光法检测基础LH和GnRH激发试验，女童在8岁之前出现第二性征定义为性早熟女童(PP女童)，符合单纯乳房早发、骨龄(BA)没有提前、基础LH0.83*、具有完整的临床数据这四个条件的定义为部分性性早熟(PPP)，符合骨龄提前(BA-CA2)、生长速度加快、基础LH0.83*、GnRH激发试验*(LH峰值5.0，LH/FSH0.6)、卵泡直径≥4mm(多个)、具有完整的临床数据这五个条件的定义为中枢性性早熟(CPP)，符合以下四个条件：临床数据不完整、BA-CA1，但基础LH0.83*、BA-CA1，但基础LH0.83*，GnRH激发试验*(LH峰值5.0，LH/FSH0.6)之一的定义为其他类型性早熟；

各术语定义如下：

LH:黄体生成素

FSH:促卵泡激素

BA：骨龄(诊断时)

CA：实际年龄(诊断时)

GnRH：促性腺激素释放激素

所有的血清样本均在清晨空腹下抽血，静置30min或以上，然后在4℃下离心，分离血清后储存在-80℃冰箱中；

S2.血清样品配置及NMR波谱检测

血清样品在4℃下解冻，并将血清与pH为7.4的磷酸盐缓冲液混合，然后涡旋10s。在4℃下以16000g离心10min，将上清液转移到5mmNMR管中；

血清样品的¹H-NMR波谱是在配备低温探头的BrukerAV-600核磁共振谱仪上采集。采样参数为：质子共振频率600.13MHz；仪器工作温度298K；采用典型的带压水的CPMG脉冲序列，谱宽为12019.2Hz，采集时间为1.36s，弛豫延迟为4.0s，扫描次数为64次，采样点为16K；

S3.血清¹H-NMR谱图处理

将采集到的¹H-NMR谱图使用MestReNova软件进行处理。选用δ1.33ppm处的乳酸双峰作为标准对¹H-NMR谱定标。将所有单一谱图叠加得到叠加谱图，观察谱峰对齐情况，稍作部分调整，当确定所有谱峰对齐后，去除δ4.70–δ5.17和δ5.50–δ6.00的光谱区域，其余谱图区域(δ0.55–δ8.60)以0.002ppm等间距分段积分；

S4.血清代谢谱代谢物的鉴定和含量变化

根据所得的血清¹H-NMR谱图谱峰信息，结合Chenomx NMR Suite 8.1软件和公共人类代谢组数据库HMDB对谱图谱峰信息进行解析，选取重叠最少的特征峰进行相应代谢物的定量及后续分析；

S5.PPP女童的潜在生物标志物的筛选

¹H-NMR数据采用SIMCA软件进行多元统计学分析，包括主成分分析(PCA)和正交投影偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)。采用自适应换算方法(UV)对数据集进行缩放，使每个变量具有相同的方差。首先，进行PCA分析，判断各样本(PAD，AD和PP女童)的代谢轮廓与代谢轮廓重叠情况，再进一步进行OPLS-DA分析，根据潜在生物标志物的筛选标准，筛选出PP女童的生物标志物；

进一步寻找CPP和PPP女童潜在生物标志物，首先分别运用PCA分析了CPP女童与PAD和AD女童的血清代谢谱，PPP女童与PAD和AD女童的血清代谢谱。进一步进行OPLS-DA分析，根据潜在生物标志物的筛选标准，筛选出CPP女童的生物标志物与PPP女童的生物标志物；

S6.PPP女童特异性生物标志的物确定及生物标志物群的灵敏度和特异性的分析

将筛选得到的PP、CPP和PPP女童的血清生物标志物，进行差异代谢组分析，以获得PPP女童的特异性生物标志物，并绘制Venn图，得出PPP女童所特有的生物标记物。

进一步，基于随机森林的探索性受试者操作特征(ROC)曲线分析被用于测试疾病特异性生物标志物的敏感性，并确定相应ROC曲线下面积(AUC)和置信区间(Cl)，用于评价PPP女童特异性生物标志物的灵敏度和特异性。