[发明专利]一种分离培养摇蚊科昆虫肠道细菌的方法

说明书

本发明公开了一种分离培养摇蚊科昆虫肠道细菌的方法，属于微生物技术领域。该方法包括：摇蚊肠道组织剥离、从肠道内含物中制备菌群沉淀、原始菌液经稀释后于四种不同培养基中进行有氧培养、菌落形态鉴定、菌株DNA提取及分子鉴定。本发明提供的方法够快速分离摇蚊幼虫完整肠道，同时从红裸须摇蚊肠道中获得16种不同遗传型细菌，分属2门9科16属。所述分离鉴定方法为水生昆虫肠道菌群资源库的开发提供了一定的思路，为体外研究摇蚊肠道菌株功能奠定基础。

技术领域

本发明属于微生物学技术领域，特别是涉及一种分离摇蚊科昆虫完整肠道并培养肠道细菌的方法。

背景技术

摇蚊，隶属于双翅目摇蚊科，在全世界分布广泛，数量和种类极其庞大，是一类十分常见，耐受能力极强的水生昆虫，在各类水域均有广泛分布。摇蚊幼虫，俗称血虫、红虫，其生物量已经占到全部水生底栖动物的70％-80％，是鱼类天然饵料。摇蚊幼虫地理分布广泛，从热带沼泽到极地，从海洋到海拔5000米以上的冰川积水中，在水体严重污染的环境下（富营养化程度高）仍然能够大量生存，甚至有水体富营养化程度越高，摇蚊幼虫生物量越大的趋势。

作为地球上数量最多的动物群体，昆虫种类繁多、形态各异，其微生物群落主要特定地集中在消化道部位，换句话说，昆虫肠道内也栖息着大量特化的微生物群落。昆虫肠道微生物群落主要包括病毒、古细菌、细菌、真菌和原生动物等，而种类繁多的细菌具有显著优势，如变形菌（Proteobacteria）、厚壁菌（Firmicutes）、放线菌（Actinomycetes）、拟杆菌（Spirochetes）等,不同种群的肠道微生物群落组成存在差异，即使是同一物种，微生物群落结构也在不同个体的不同状态下表现出表型差异。通常认为，昆虫肠道微生物群落结构被证实高度依赖于栖息地生态环境与食物种类，昆虫从食物或环境中获得微生物，并经过肠道选择后形成共生菌。但近些年，越来越多的研究报道发现昆虫肠道微生物也与环境中潜在污染（农药、植物代谢物、重金属含量）、季节变化、不同变态发育阶段等多方因素息息相关。

近年来国内外研究发现，昆虫肠道内微生物可以通过直接或间接途径帮助昆虫缓解甚至消除外源有毒物质对个体带来的不利影响。咖啡果小蠹 （Hypothenemus hampei）肠道微生物群落中的假单胞菌属以咖啡因作为唯一的碳氮源，以此帮助昆虫个体对有害物质咖啡因进行降解。跳蚤甲虫（PsyLLiodes chrysocephaLa）肠道微生物中的泛菌属被认为能够降解十字花科植物代谢产生的异硫氰酸盐。蜜蜂肠道微生物可以通过提高蜜蜂的内源性解毒酶表达量来帮助个体抵御噻虫啉和氟缬氨酸两类杀虫剂，促进蜜蜂的健康。而摇蚊幼虫在水体严重污染的环境下仍然能够生存，甚至呈现污染越严重，生物量越大的趋势，并且摇蚊属于无脊椎动物，不同于脊椎动物，摇蚊不具备特异性免疫细胞与相关抗体，因而肠道微生物在摇蚊个体抵御外界不良环境过程中必然发挥了不可替代的作用，但其肠道微生物介导的个体抵御有害物质的过程中发挥的作用还未见报道。为了解肠道微生物在帮助摇蚊对环境或病原微生物的有效防御，挖掘并研究相关微生物，深入了解肠道微生物在免疫应答过程中发挥的具体机制，分离培养摇蚊肠道微生物变得尤为重要。

昆虫肠道这一特殊环境中栖息着大量特化的微生物群落以及共生菌群，其种类与数量都是难以计数的，尽管摇蚊幼虫个体小，食量不大，但其肠道中的微生物数量仍十分可观。本发明结合传统的微生物培养方法和分子生物学的方法，将可培养细菌从肠道这一特殊环境中分离出来并纯化，进行16S rRNA基因分析，为进一步分析摇蚊幼虫及其他无脊椎动物在肠道微生物抵御不良环境发挥的免疫机制提供重要的研究方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够快速分离摇蚊科昆虫红裸须摇蚊幼虫完整肠道的方法，该方法能够快速分离得到完整的摇蚊幼虫肠道，包括前肠、中肠、后肠，马氏管也可以完整保留，最大程度上保证了肠道的完整性，避免了机械损伤和实验材料的污染，同时从红裸须摇蚊肠道中获得16种不同遗传型细菌，分属2门9科16属，为接下来的水生无脊椎动物肠道微生物群落及功能分析提供了良好的研究方法。