[发明专利]一种分离培养摇蚊科昆虫肠道细菌的方法

权利要求书

1.一种分离培养摇蚊科昆虫肠道细菌的方法，其特征在于：按如下的步骤进行：

一、预处理

1肠道组织剥离

（1）材料消毒：在无菌环境下，将摇蚊幼虫置于冰上3-5 min使其昏迷后进行表面消毒，用75％的酒精棉片轻轻擦拭幼虫表面30 s，0.25％的无菌次氯酸钠冲洗幼虫表面1 min，无菌生理盐水冲洗浸泡幼虫表面三次，每次1 min，去除虫体表面残留液体；

（2）材料处理：将体表消毒好的摇蚊幼虫放在培养皿中载玻片上，使用灭菌后的解剖刀切开幼虫口器和尾部，用灭菌后的镊子从幼虫头部轻轻取出肠道，立即用无菌生理盐水漂洗肠道，去除其它内脏及其附属物，采集肠道及其内容物；

2菌落培养

（1）菌液制备：在1.5 mL的离心管中加入1 mL PBS缓冲液，将剖离的肠道装入无菌离心管中，用匀浆器将肠道充分研磨形成匀浆后备用；

（2）菌液稀释：将上述提取的肠道匀浆液稀释为10^-3、10^-4、10^-5三个梯度，分别取100 μL溶液均匀涂布于NA、LB、BHI、MC培养基上；

（3）平板倒置放入人工气候箱中37℃培养72 h，选择菌落分散较好，单菌落数目在30-300株的培养皿，每24 h根据菌落特征，分别挑取形态、大小、颜色不同的单菌落在新的培养基上划线纯化培养3-5次，直至得到形态稳定的单克隆菌株；

3菌落形态鉴定

观察并记录单菌落的颜色，形状及质地等特征，经过革兰氏染色后在光学显微镜下观察单个细菌的革兰氏染色情况、菌体形状、有无鞭毛等特征，剔除重复菌株；

二、细菌基因组DNA的提取及分子鉴定

1扩繁：在玻璃试管中加入3 mL培养基并接种纯化的单克隆菌株，摇床设置为36℃，220/RPM，试管放入摇床三天，直至菌液OD值为0.7-1.0即可取出；

2提取基因组DNA

（1）取1.5 mL离心管，加入上述菌液后离心机室温，8000/RPM离心1 min，弃上清；

（2）使用细菌基因组DNA抽提试剂盒中的试剂提取细菌基因组DNA：加入180 μL BufferDigestion，80 μL溶菌酶，振荡混匀后放入37℃水浴锅中水浴60 min，每隔10 min上下颠倒混匀一次；

（3）加入20 μL Proteinase K,震荡混匀后56℃水浴过夜；

（4）加入20 μL RNase A（10 mg/mL），室温放置30 min；

（5）加入200 μL Buffer BD，充分混匀，70℃水浴10 min；

（6）加入200 μL无水乙醇，充分混匀；

（7）将吸附柱放入收集管中，管内物质移入收集管柱中，静置2 min，再12000/RPM室温离心1min，倒掉收集管中的废液；

（8）加入500 μL PW Solution，12000/RPM离心1 min；

（9）加入500 μL Wash Solution，12000/RPM离心1 min，此步骤重复2次；

（10）离心管12000/RPM空转2 min，倒掉废液，打开吸附柱盖子于室温放置5 min；

（11）取新的1.5 mL离心管，加入80mL CE Buffer，静置5 min，12000/RPM离心2 min，收集DNA溶液；产物立即使用或保存于-20℃冷冻；

3分子鉴定：

（1）扩增菌体的16S rRNA基因序列后测序，扩增菌体的16S rRNA基因序列使用细菌通用引物27F和1492R扩增；

（2）获得的菌株序列通过DNAMAN软件进行矫正及拼接，拼接完成后的16S rRNA序列提交到http://www.ncbi.nlm.nih.gov中与GenBank核酸数据库中的序列进行BLAST同源性比对，查找并选出与菌株相似度最高的序列作为参照菌株并下载核酸序列，使用ClustalW软件比对序列，运用软件MEGA X以邻位相连算法（Neighbor-Joining）构建系统发育树，判定其亲缘关系。

2.权利要求1所述一种分离培养摇蚊科昆虫肠道细菌的方法在用于快速分离摇蚊幼虫完整肠道，同时从肠道中获得可培养微生物方面的应用。