[发明专利]快速获得基因型和表型突变的CRISPR/Cas9基因敲除方法及应用

说明书

本发明公开了一种快速获得基因型和表型突变的CRISPR/Cas9基因敲除方法及应用，属于基因编辑技术领域。本发明快速获得基因型和表型突变的CRISPR/Cas9基因敲除方法是通过在CRISPR/Cas9基因组编辑系统中引入多个靶向sgRNAs，从而实现通过PCR凝胶电泳完成长片段缺失的基因型检测以及G0代镶嵌性突变的表型检测方法，增加编辑效率；对于因繁殖周期较长或者不能实现实验室全生活史养殖而难以获得F1代的非模式动物，以及发育致死基因的功能研究，在G0代即能观察到镶嵌性突变表型。

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种快速获得基因型和表型突变的CRISPR/Cas9基因敲除方法及应用。

背景技术

非模式动物包括含有重要生物学意义和农业经济潜力的性状，其反向遗传学研究将从根本上解析非模式动物的独特性状和经济性状。但大多数非模式动物面临繁殖周期长和难以实现实验室全周期培养的瓶颈，在快速获得遗传操作纯系方面成本高，耗时长，难度大。

基因编辑技术是近年来研究基因功能和解析性状最直接有效的方法，在高等动物和模式动物中，基因编辑技术在基因功能研究中已得到广泛应用，从早期的TALENs、ZFNs基因编辑技术，到现在广泛应用的CRISPR/Cas9基因编辑技术。规律成簇的间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats,CRISPR)广泛存在细菌和古生菌内的免疫系统。作为一种编辑工具，CRISPR系统能够定点修饰基因组。与TALENs、ZFNs基因编辑技术相比，CRISPR/Cas9基因编辑技术因具有操作简单、靶点选择广、成本低、效率高等优点，自诞生以来便受到了广大科研人员的关注并得到迅速发展。CRISPR/Cas9技术一方面极大促进了模式物种尤其是非模式动物的基因功能研究，另一方面为重要农业物种经济性状的遗传解析提供了最直接有力的工具。目前，CRISPR系统已被广泛应用于药物研制、疾病治疗、动物模型和生物遗传育种等方面，研究者利用CRISPR/Cas9技术已成功的在人类、小鼠、拟南芥、高粱、斑马鱼、线虫、果蝇、山羊、牛、猪、家蚕、牡蛎、脊尾白虾等多种动植物中实现基因编辑。

CRISPR系统在缺乏供体模板的情况下，可以通过sgRNA在基因组的特定位点产生切割，继而引发宿主细胞的非同源末端连接NHEJ修复实现基因组编辑，NHEJ效率较高，随机产生片段插入和缺失，但单个sgRNA引发的缺失片段一般较短，无法快速筛选基因型突变体。此外，CRISPR系统在非模式动物的表型检测方面也存在许多局限，例如：因非模式动物繁殖周期长筛选F1代纯系周期长；因实验室全生活史培养体系受限无法获得F1代；因突变体致死无法获得纯系，而无法得到发育致死基因的突变体。

因此，在非模式动物中优化CRISPR系统，以实现简单、快速、高效的筛选突变体基因型和表型，研究靶基因功能的方法仍然有待进一步探索。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种通过在CRISPR/Cas9基因组编辑系统中引入多个靶向sgRNAs，从而实现通过PCR凝胶电泳完成长片段缺失的基因型检测以及G0代镶嵌性突变的表型检测方法，增加编辑效率。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种快速获得基因型和表型突变的CRISPR/Cas9基因敲除方法，包含如下步骤：

针对靶基因设计2条以上sgRNAs；将sgRNAs与Cas9蛋白按照浓度配比为1:1的浓度配比制备成sgRNA和Cas9蛋白复合物；将sgRNA和Cas9蛋白复合物导入受精卵中，实现靶基因的长片段缺失突变；

提取基因编辑后幼虫基因组DNA，PCR扩增目的片段，通过凝胶电泳观察目的条带的大小，确定长片段缺失的突变条带，能够快速检测到基因型突变；

对基因编辑后的幼虫进行原位杂交并借助扫描电镜检测，能够在G0代即观察到镶嵌性突变表型。