[发明专利]快速获得基因型和表型突变的CRISPR/Cas9基因敲除方法及应用

权利要求书

1.一种快速获得基因型和表型突变的CRISPR/Cas9基因敲除方法，其特征在于，包含如下步骤：

针对靶基因设计2条以上sgRNAs；将sgRNAs与Cas9蛋白按照浓度配比为1:1的浓度配比制备成sgRNA和Cas9蛋白复合物；将sgRNA和Cas9蛋白复合物导入受精卵中，实现靶基因的长片段缺失突变；

提取基因编辑后幼虫基因组DNA，PCR扩增目的片段，通过凝胶电泳观察目的条带的大小，确定长片段缺失的突变条带，能够快速检测到基因型突变；

对基因编辑后的幼虫进行原位杂交并借助扫描电镜检测，能够在G0代即观察到镶嵌性突变表型。

2.权利要求1所述基因敲除方法在非模式动物基因编辑中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的非模式动物为水产经济贝类。

4.一种长牡蛎中快速获得基因型和表型突变的CRISPR/Cas9基因敲除方法，其特征在于，步骤如下：

针对长牡蛎β-tubulin基因设计5条sgRNAs；将sgRNAs与Cas9蛋白按照浓度配比为1:1:1:1:1:1的浓度配比制备成sgRNA和Cas9蛋白复合物；将sgRNA和Cas9蛋白复合物导入受精卵中，实现β-tubulin基因的长片段缺失突变；

提取基因编辑后幼虫基因组DNA，PCR扩增目的片段，通过凝胶电泳观察目的条带的大小，确定长片段缺失的突变条带，能够快速检测到基因型突变；

对基因编辑后的幼虫进行原位杂交并借助扫描电镜检测，能够在G0代即观察到镶嵌性突变表型。

5.根据权利要求4所述长牡蛎中快速获得基因型和表型突变的CRISPR/Cas9基因敲除方法，其特征在于，所述将sgRNA和Cas9蛋白复合物导入受精卵中的方法为电穿孔法。

6.根据权利要求5所述长牡蛎中快速获得基因型和表型突变的CRISPR/Cas9基因敲除方法，其特征在于，所述电穿孔法的实验参数为40V/50ms。

7.根据权利要求5所述长牡蛎中快速获得基因型和表型突变的CRISPR/Cas9基因敲除方法，其特征在于，所述电穿孔法的100μL电穿孔实验体系包含电转缓冲液60μL，sgRNA和Cas9蛋白复合物10μL，受精卵30μL；电转缓冲液为使用天然海水配制的0.77M甘露醇溶液；sgRNA和Cas9蛋白复合物中sgRNA与Cas9蛋白终浓度为30ng/μL；受精卵的浓度为1000个/μL。

8.根据权利要求4-7任一项所述长牡蛎中快速获得基因型和表型突变的CRISPR/Cas9基因敲除方法，其特征在于，所述5条sgRNAs由以下方法获得：

(1)根据SEQ ID NO:1所示的长牡蛎β-tubulin基因的核酸序列，设计长牡蛎β-tubulin基因的5个sgRNA位点，并针对这5个靶位点，设计5条长牡蛎β-tubulin基因sgRNA引物分别如SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:6所示；

(2)使用特异性引物SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:6与通用引物合成sgRNAs的DNA模板；进行体外转录获得长牡蛎β-tubulin基因的sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3、sgRNA4、sgRNA5。