[发明专利]一种适用于链霉菌活细胞的功能核酸探针导入方法及其应用

说明书

本发明公开了一种适用于链霉菌活细胞的功能核酸探针导入方法，本发明首先构建了四环素特异性分子信标核酸探针FAM‑Tc‑BHQ1，然后将FAM‑Tc‑BHQ1与穿膜肽KH₉‑BP100于室温进行混合孵育，制备穿膜肽‑核酸适配体分子信标复合物，并且提供了一种适用于链霉菌活细胞的功能核酸探针导入方法。本发明以四环素类抗生素产生菌金色链霉菌为模型，开展了穿膜肽介导的四环素特异性分子信标的活细胞载运及靶标检测研究。本发明采用穿膜肽非共价偶联四环素特异性分子信标，实现了分子信标的金色链霉菌活细胞载运及胞内四环素的单细胞水平活细胞荧光检测。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种适用于链霉菌活细胞的功能核酸探针导入方法。

背景技术

核酸适配体分子信标(Molecular becon)是一种根据荧光共振能量转移原理构建的功能核酸(Functional Nucleic Acid)生物传感器。核酸适配体分子信标具有典型的茎环结构：包括一个可特异性识别靶标物质的核酸适配体环区，和分别连接有荧光基团和淬灭基团、并且碱基序列互补的两个茎区。当体系中不存在待检测靶标时，核酸适配体分子信标茎区碱基发生互补，荧光基团和淬灭基团的距离十分接近(＜10nm)，荧光基团与淬灭基团二者之间发生荧光共振能量转移，荧光几乎完全被淬灭。相反，当体系中存在待检测靶标时，核酸适配体环区与靶标发生结合，修饰有荧光基团和淬灭接团的茎区打开，使得二者相互远离，荧光恢复。体系的荧光强度与靶标分子的浓度呈正相关。

近年来，分子信标已经在动物活细胞内靶标物质的实时在线检测中具有广泛的应用。以分子信标生物传感器进行靶标检测方法简单易行，无需对待检测细胞进行基因工程改造以组装识别、报告元件，也无需开展确保两组原件行驶正常功能的体内互作研究及改造工作。目前，已经在动物活细胞中实现了基于分子信标的多种靶标示踪检测，如病毒基因组、蛋白质、ATP等。可采用诸如病毒载体、脂质分子、细胞穿膜肽、纳米材料等辅助跨膜运载系统将核酸适配体运输至细胞内部，或采用含有细胞受体识别与靶标识别双功能的嵌合适配体经受体介导的内吞进入细胞。

建立基于核酸适配体分子信标检测微生物活细胞胞内靶标的方法，将为在生理条件下更好地了解微生物代谢产物合成途径提供帮助，更是实现微生物单个活细胞水平生理生化研究的趋势所向。应用微生物活细胞代谢产物生物传感器，可在单细胞层次实现胞内代谢产物的快速浓度响应，有助于实现菌种代谢途径的活细胞解析和高产菌株的快速筛选，在工业菌种高通量筛选领域展现了良好的应用前景。

但目前，功能核酸生物传感器在微生物活细胞代谢产物检测中的应用受限。究其原因，可能是微生物细胞除细胞膜屏障外还具有复杂的细胞壁结构，同时微生物细胞不具有内吞作用，其摄取外界物质的方式与动物细胞也不尽相同。目前，尚缺少适用于微生物细胞的核酸适配体辅助跨膜运载系统。建立针对特定微生物细胞类型的适配体辅助跨膜运载系统，将为实现“点亮”微生物活细胞代谢产物奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于链霉菌活细胞的功能核酸探针导入方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明首先提供一种四环素特异性分子信标核酸探针FAM-Tc-BHQ1，其序列如下：

5’-FAM-CCGGCGGGCCCCCGGCAGGCCACGGCTTGGGTTGGTCCCACTGCGCGTCCCGCCGG-BHQ1-3’

本发明还提供一种穿膜肽-核酸适配体分子信标复合物的制备方法：将所述的FAM-Tc-BHQ1与穿膜肽KH₉-BP100于室温进行混合孵育30-60min。

进一步的，所述FAM-Tc-BHQ1与KH₉-BP100的摩尔浓度比为5μM∶25-150μM。