[发明专利]一种细胞色素P450 BM3突变酶及其在生物催化合成对羟基联苯中的应用

说明书

本发明提供了一种细胞色素P450BM3突变酶及其在生物催化合成对羟基联苯中的应用，所述细胞色素P450BM3突变酶为在野生型细胞色素P450BM3单加氧酶的氨基酸序列的第87位和第267位中进行了氨基酸突变，具体包括：A、所述细胞色素P450BM3突变酶为单一位点的点突变，所述点突变包括：E267V或者F87G；B、或者所述细胞色素P450BM3突变酶为两个位点的突变，为E267V和F87G。本发明提供的细胞色素P450单加氧酶突变体P450BM3对联苯的羟化活力比野生型CYP活力提高了将近1.5倍，具有较稳定的催化效果。且反应条件温和，无高温高压的环境。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种细胞色素P450 BM3突变酶及其在生物催化合成对羟基联苯中的应用。

背景技术

对羟基联苯为白色针状或片状固体，分子式为C₁₂H₁₀O，分子量为170，CAS号为92-69-3，熔点为164.5℃，沸点为306.5℃，几乎不溶于水。可以用作染料；树脂和橡胶的中间体。用它合成的红光增感，绿光增感染料是彩色影片的主要原料之一。也可用作分析试剂，如，比色测定乙醛和乳酸、定量测定胞壁酸。脱氧核糖核酸酶Ⅰ的抑制剂。染料、树脂和橡胶的中间体、杀菌剂、水溶性漆的增溶剂。其合成主要以磺化法生产苯酚的副产蒸馏残渣为原料，通过真空蒸馏截取苯基苯酚馏分，再用邻苯基苯酚与对苯基苯酚在三氯乙烯中的溶解度差异，实现异构体分离。也可由对氯联苯在高温下水解而得。该方法存在收率不高、不环保、操作繁琐等问题。

细胞色素P450单加氧酶(P450)可以高效率、高选择性地催化各种具有复杂骨架有机化合物进行氧化反应，被誉为自然界的万能催化剂。近年来，利用P450单氧化酶催化C-H键活化的研究越来越多。P450 BM3(CYP102A1)是一种来源于巨大芽胞杆菌(Bacillusmegaterium)的脂肪酸羟化酶，其独特性在于P450 BM3是一种天然的血红素铁依赖的单氧化酶和能传递电子的NADPH依赖的黄素还原酶的融合酶，其拥有自给自足的电子传递系统，仅需添加NADPH就能启动反应。P450 BM3单氧化酶的这种优势使其成为近年来的研究热点，特别是针对其对非天然底物的选择性低的问题，通过蛋白质工程对其进行定向进化改造，以控制其选择性，甚至创造原始P450所不能催化的新的反应类型。

因此，有必要开发一种具有较高催化效率的细胞色素P450突变体用于生物催化合成对羟基联苯。

发明内容

本发明目的是提供一种催化产品及其在生物催化合成对羟基联苯中的应用，筛选出一种细胞色素P450 BM3突变酶，相比与野生型有更高的催化效率。

在本发明的第一方面，提供了一种细胞色素P450 BM3突变酶，所述细胞色素P450BM3突变酶为在野生型细胞色素P450BM3单加氧酶的氨基酸序列的第87位和/或第267位中进行了氨基酸突变，包括：

进一步地，所述细胞色素P450 BM3突变酶为单一位点的点突变，所述点突变包括：E267V或者F87G；

或者所述细胞色素P450 BM3突变酶为两个位点的突变，为E267V和F87G。

进一步地，编码所述细胞色素P450 BM3突变酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：2或SEQID NO：3所示。

在本发明的第二方面，提供了一种编码所述细胞色素P450 BM3突变酶的核酸分子。

在本发明的第三方面，提供了一种细胞色素P450 BM3突变酶表达载体，所述表达载体包含有所述核酸分子。

进一步地，所述表达载体包括原核表达载体和病毒载体中的一种。

在本发明的第四方面，提供了一种包含所述表达载体的重组菌或工程化细胞系。