[发明专利]一种差异化富集小片段核酸分子的方法

说明书

本发明公开了一种差异化富集小片段核酸分子的方法，裂解后的样品在低乙醇浓度下与第一磁珠结合，分离上清液和第一磁珠，上清液在高乙醇浓度下与第二磁珠结合，保留第二磁珠并洗脱，得到小片段核酸分子，其中低乙醇浓度是指反应体系中乙醇浓度为5％‑20％(V/V)，高乙醇浓度是指反应体系中乙醇浓度为21％‑35％(V/V)。本发明提供了一种差异化富集小片段核酸分子的方法，尤其是小片段核酸富集的提取方法，通过改变结合体系中乙醇的终比例，从而实现先将大片段核酸结合并分离，再将小片段核酸结合并富集的过程。使用本发明的方法，可以富集母体内游离的小片段胎儿DNA，用于后续检测，降低假阳性率。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种差异化富集小片段核酸分子的方法。

背景技术

随着医疗技术的发展，无创产前胎儿检测逐渐成为热门检测项目，减少了胎儿因出生缺陷导致的早期流产、死胎、先天残疾的情况发生。母血血浆中胎儿游离DNA正是无创产前诊断的主要研究目标。但是，由于胎儿游离DNA长度较短，片段长度一般小于300bp，母血血浆中胎儿游离DNA含量少，母体游离DNA含量多的缘故，导致无创产前诊断易出现假阳性的结果，给诊断带来困扰。因此，急需一种能够分离血浆游离DNA的方法，能够去除母血血浆中来源于母体的大片段游离DNA，又能够富集母血血浆中胎儿的小片段游离DNA的提取方法。

发明内容

本发明提供了一种差异化富集小片段核酸分子的方法，该方法可以在提取过程中分离样本中大片段核酸，保留并提取样本中的小片段核酸。

本发明采用的技术方案为：

一种差异化富集小片段核酸分子的方法，其特征在于：裂解后的样品在低乙醇浓度下与第一磁珠结合，在该过程中，大片段核酸分子会结合到第一磁珠上，而小片段核酸分子仍留存在溶液中；分离上清液和第一磁珠，上清液在高乙醇浓度下与第二磁珠结合，保留第二磁珠并洗脱，得到小片段核酸分子，其中低乙醇浓度是指反应体系中乙醇浓度为5％-20％，高乙醇浓度是指反应体系中乙醇浓度为21％-35％，且高于低乙醇浓度。本发明所指的小片段核酸分子，通常是指500bp以下的核酸片段，甚至300bp以下的片段。大片段核酸分子通常指大于500bp的核酸片段。

优选的，其步骤包括:

(1)样本裂解：在血浆样本中加入蛋白酶K和裂解液，进行裂解反应；

(2)大片段核酸分子的吸附：向裂解产物中加入结合液、乙醇和第一磁珠，进行吸附反应，所述第一磁珠为硅基磁珠，其中乙醇的加入量为使反应体系中乙醇浓度控制在5％-20％，其中结合液的作用为促进核酸与磁珠结合。

(3)分离第一磁珠和上清液：将步骤(2)获得的反应体系置于磁力架上，分离第一磁珠和上清液；

(4)小片段核酸分子的吸附：向上清液中加入乙醇和第二磁珠，使反应体系中乙醇浓度为21％-35％，进行吸附反应，所述第二磁珠为硅基磁珠；

(5)分离第二磁珠和上清液：将步骤(4)获得的反应体系置于磁力架上，分离第二磁珠和上清液；

(6)小片段核酸分子的回收：将第二磁珠置于洗脱液中，进行洗脱反应，然后分离磁珠和洗脱液，回收洗脱液，得到富集的小片段核酸分子。

优选的，在进行小片段核酸分子的回收之前，先对分离的第二磁珠进行洗涤。

优选的，步骤(1)中蛋白酶K：样品：裂解液的比例为40μL：1mL:125μL，反应过程为60℃孵育20min。

优选的，步骤(2)中裂解产物：结合液：第一磁珠的比例为1165μL：600μL：20μL，反应过程为室温颠倒混匀10min。

优选的，步骤(4)中第二磁珠的加入量与第一磁珠的加入量基本相同，反应过程为室温颠倒混匀10min。