[发明专利]一种差异化富集小片段核酸分子的方法

权利要求书

1.一种差异化富集小片段核酸分子的方法，其特征在于：裂解后的样品在低乙醇浓度下与第一磁珠结合，分离上清液和第一磁珠，上清液在高乙醇浓度下与第二磁珠结合，保留第二磁珠并洗脱，得到小片段核酸分子，其中低乙醇浓度是指反应体系中乙醇浓度为5％-20％V/V，高乙醇浓度是指反应体系中乙醇浓度为21％-35％V/V。

2.如权利要求1所述的差异化富集小片段核酸分子的方法，其特征在于其步骤包括:

(1)样本裂解：在血浆样本中加入蛋白酶K和裂解液，进行裂解反应；

(2)大片段核酸分子的吸附：向裂解产物中加入结合液、乙醇和第一磁珠，进行吸附反应，所述第一磁珠为硅基磁珠，其中乙醇的加入量为使反应体系中乙醇浓度控制在5％-20％；

(3)分离第一磁珠和上清液：将步骤(2)获得的反应体系置于磁力架上，分离第一磁珠和上清液；

(4)小片段核酸分子的吸附：向上清液中加入乙醇和第二磁珠，使反应体系中乙醇浓度为21％-35％，进行吸附反应，所述第二磁珠为硅基磁珠；

(5)分离第二磁珠和上清液：将步骤(4)获得的反应体系置于磁力架上，分离第二磁珠和上清液；

(6)小片段核酸分子的回收：将第二磁珠置于洗脱液中，进行洗脱反应，然后分离磁珠和洗脱液，回收洗脱液，得到富集的小片段核酸分子。

3.如权利要求2所述的差异化富集小片段核酸分子的方法，其特征在于：在进行小片段核酸分子的回收之前，先对分离的第二磁珠进行洗涤。

4.如权利要求2所述的差异化富集小片段核酸分子的方法，其特征在于：步骤(1)中蛋白酶K：样品：裂解液的比例为40μL：1mL:125μL，反应过程为60℃孵育20min。

5.如权利要求4所述的差异化富集小片段核酸分子的方法，其特征在于：步骤(2)中裂解产物：结合液：第一磁珠的比例为1165μL：600μL：20μL，反应过程为室温颠倒混匀10min。

6.如权利要求5所述的差异化富集小片段核酸分子的方法，其特征在于：步骤(4)中第二磁珠的加入量与第一磁珠的加入量基本相同，反应过程为室温颠倒混匀10min。

7.如权利要求6所述的差异化富集小片段核酸分子的方法，其特征在于：步骤(6)中第二磁珠：洗脱液的比例为20μL：50μL，反应过程为涡旋混匀10min。

8.如权利要求3所述的差异化富集小片段核酸分子的方法，其特征在于：所述对分离的第二磁珠进行洗涤具体为：在第二磁珠内加入洗涤液，涡旋混匀2min，在磁力架上分离第二磁珠和洗涤液。

9.如权利要求2所述的差异化富集小片段核酸分子的方法，其特征在于：所述裂解液包含1-3M盐酸胍，0.2％-1％m/V的NP-40，0.2％-1.5％m/V的SDS。

10.如权利要求2所述的差异化富集小片段核酸分子的方法，其特征在于：所述结合液包含3-6M盐酸胍和/或硫氰酸胍，0.2％-5％m/V的Triton X-100，0.2％-2％m/V的N-月桂酰肌氨酸钠，0.2％-5％m/V的NP-40。