[发明专利]一种MK-7的发酵生产方法

说明书

本发明公开了一种利用纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)生产MK‑7的发酵工艺，属于微生物发酵领域。本发明在纳豆芽孢杆菌的发酵过程中采用分阶段补加液体脂类，分阶段控制发酵液pH值，分阶段控制残糖含量的工艺，其中补加的液体脂类既可作为碳源利用，又能将发酵液中的MK‑7萃取到油相中，降低反馈抑制从而提高MK‑7产量。利用该工艺进行纳豆芽孢杆菌发酵生产MK‑7产量高，发酵工艺简单可控，有利于MK‑7的工业化扩大生产。

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种纳豆芽孢杆菌的液体深层发酵工艺，更具体涉及一种利用纳豆芽孢杆菌进行液体发酵生产MK-7的方法。

背景技术

维生素K2(Menaquinone，MK，VK2)是一类甲萘醌类化合物的统称，化学结构式为2-甲基-3-烯基-1,4-萘醌，根据C-3侧链上异戊二烯单元的个数，MK可分为14种，以MK-n表示(n＝1-14)，代表性的分子是MK-4和MK-7。已知MK-7是活性最强的维生素K2中的一种，其具备功能广泛、活性强大、半衰期长、安全等特点，主要对细胞的生长代谢及防止心脑血管和肾脏血管的钙化起着非常重要的作用。

维生素K2微生物发酵生产菌株主要包括革兰氏阳性菌中的纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)和革兰氏阴性菌中的黄杆菌属(Flavobacterium sp.)。其中纳豆芽孢杆菌主要产维生素K2，又因其菌体本身为益生菌，所产的维生素K2也具有较高的产量和较好的生物相容性，因此是发酵生产维生素K2的优良菌种。但是现有微生物发酵水平相对较低，从而导致成本过高，这是限制纳豆芽孢杆菌发酵生产维生素K2的一个主要原因。因此，研究发酵菌株特性及发酵行为对于提高发酵生产维生素K2的生产性能具有重要意义。

2016年，牟杰等以香菇菌渣复配蛋白胨为氮源(5％)、甘油为碳源(5％)，采用高转速(600r/min)、高溶氧量(DO20％)进行纳豆芽孢杆菌发酵时,VK2收率最高可达35.58mg/L(牟杰等.纳豆芽孢杆菌生产维生素K2的连续发酵工艺优化.《食品工业科技》.2016,第19期)。

2019年，汤贵祥等筛选得到一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，使用优化后培养基(5％甘油、12％大豆蛋白胨、0.07％磷酸氢二钾、0.02％氯化钙、0.05％七水硫酸镁)进行发酵，VK2产量可达70mg/L以上(汤贵祥，《维生素K2高产菌株的筛选与发酵条件优化》.《食品工业科技》.2019，第24期)。

中国专利ZL201910822357.0：一种维生素k2(MK-7型)的发酵方法，在使用纳豆芽孢杆菌进行发酵的过程中发酵培养基配方为葡萄糖6.0％，甘油3.0％，酵母粉1.2％，大豆蛋白胨1.2％，NaCl 0.28％，KH₂PO₄ 0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，溶剂为水，pH7.0-7.2。发酵过程中流加葡萄糖，补加磷酸、氨水，分阶段严格控制pH，通过调节转速、空气流量、罐压分阶段控制溶氧，发酵液总糖浓度控制在0.3-0.7％左右，发酵单位可达80mg/L。

中国专利申请CN111549079 A：一种采用微生物发酵法制备维生素K2的方法，在纳豆枯草芽孢杆菌发酵过程中，分阶段将OUR、发酵液中ORP及乳酸浓度中的至少一者控制在预定范围内；在发酵培养5～20h后，往发酵液中加入辅料，所述辅料选自烟酰胺、维生素B12和甲硫氨酸中的至少一种，发酵产量可达139mg/L。

虽然众多研究开展了微生物发酵生产VK2的研究，但发酵技术仍不成熟。针对发酵过程中生物量低、生产速率低等问题，本发明对纳豆芽孢杆菌深层液体发酵生产MK-7的发酵条件进行优化，达到提高最终菌体生物量和目标产物产率的目的，以期实现MK-7的大规模工业化生产。

发明内容