[发明专利]一种构建杂交捕获测序文库的方法

权利要求书

1.一种构建杂交捕获测序文库的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)文库混合

按公式(1)计算子文库的体积，将子文库进行混合，得到混合文库，其中，V_n代表第n个子文库的体积，单位为μL；

M代表混合文库质量，单位为ng；

F_n代表第n个子文库的片段大小，单位为bp；

C_n代表第n个子文库的质量浓度，单位为ng/μL；

D_n％代表第n个子文库的校正数据量占比，计算公式为公式(2)，D_n代表第n个子文库的数据量，单位为Gb，R_n代表第n个子文库的数据量校正系数，cfDNA和gDNA类子文库的R＝1，片段主峰大小1000bp的FFPE类子文库的R＝2，片段主峰大小为500～1000bp的FFPE类子文库的R＝3，片段主峰大小＜500bp的FFPE类子文库的R＝4；

(2)文库杂交捕获

对所述混合文库进行纯化，并与杂交反应液混合进行预反应，加入捕获反应液进行捕获反应，进行洗脱及扩增，得到所述杂交捕获测序文库。

2.根据权利要求1所述的构建杂交捕获测序文库的方法，其特征在于，步骤(2)所述纯化包括：

将所述混合文库与重复区域封阻序列混合，加入纯化磁珠进行孵育，收集纯化磁珠。

3.根据权利要求1或2所述的构建杂交捕获测序文库的方法，其特征在于，步骤(2)所述纯化包括以下步骤：

(1’)将所述混合文库与重复区域封阻序列混合；

(2’)25～30℃孵育纯化磁珠20～30min，并加入步骤(1’)混合液中，25～30℃孵育5～15min；

(3’)收集纯化磁珠，并使用80％酒精洗涤，进行干燥处理。

4.根据权利要求1-3任一项所述的构建杂交捕获测序文库的方法，其特征在于，步骤(2)所述杂交反应液含有杂交反应液1、杂交反应液2和通用封阻序列；

优选地，步骤(2)所述预反应的条件包括25～30℃孵育2～10min。

5.根据权利要求1-4任一项所述的构建杂交捕获测序文库的方法，其特征在于，步骤(2)所述捕获反应液含有捕获探针。

6.根据权利要求1-5任一项所述的构建杂交捕获测序文库的方法，其特征在于，步骤(2)所述捕获反应的程序包括：90～100℃，25～35s；60～70℃，12～18h。

7.根据权利要求1-6任一项所述的构建杂交捕获测序文库的方法，其特征在于，步骤(2)所述洗脱包括：

向捕获反应的产物中加入捕获磁珠，于60～70℃孵育30～60min，加入洗脱液进行洗脱。

8.根据权利要求1-7任一项所述的构建杂交捕获测序文库的方法，其特征在于，步骤(2)所述洗脱包括以下步骤：

(1”)25～30℃孵育捕获磁珠20～60min，收集捕获磁珠并加入捕获磁珠洗脱缓冲液，再次收集捕获磁珠并加入捕获磁珠重悬液；

(2”)将重悬后的捕获磁珠加入捕获反应的产物中，60～70℃孵育30～60min；

(3”)加入洗脱缓冲液1混合，弃掉上清液；

(4”)加入洗脱缓冲液S，60～70℃孵育2～10min，弃掉上清液，重复2～4次；

(5”)加入洗脱缓冲液1混合，20～30℃孵育1～4min，弃掉上清液；

(6”)加入洗脱缓冲液2混合，20～30℃孵育1～4min，弃掉上清液；

(7”)加入洗脱缓冲液3混合，20～30℃孵育1～4min，弃掉上清液。

9.根据权利要求8所述的构建杂交捕获测序文库的方法，其特征在于，所述捕获磁珠重悬液含有杂交反应液1和杂交反应液2。

10.根据权利要求1-9任一项所述的构建杂交捕获测序文库的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)按所述公式(1)计算子文库的体积，将子文库进行混合，得到混合文库；

(2)将所述混合文库与重复区域封阻序列混合；

(3)25～30℃孵育纯化磁珠20～30min，并加入步骤(1’)混合液中，25～30℃孵育5～15min；

(4)收集纯化磁珠，并使用80％酒精洗涤，进行干燥处理；

(5)将干燥后纯化磁珠杂交反应液混合进行预反应，加入捕获反应液，进行捕获反应；

(6)25～30℃孵育捕获磁珠20～60min，收集捕获磁珠并加入捕获磁珠洗脱缓冲液，再次收集捕获磁珠并加入捕获磁珠重悬液；

(7)将重悬后的捕获磁珠加入捕获反应的产物中，60～70℃孵育30～60min；

(8)加入洗脱缓冲液1混合，弃掉上清液；

(9)加入洗脱缓冲液S，60～70℃孵育2～10min，弃掉上清液，重复2～4次；

(10)加入洗脱缓冲液1混合，20～30℃孵育1～4min，弃掉上清液；

(11)加入洗脱缓冲液2混合，20～30℃孵育1～4min，弃掉上清液；

(12)加入洗脱缓冲液3混合，20～30℃孵育1～4min，弃掉上清液；

(13)加入ddH₂O重悬，进行扩增，得到杂交捕获测序文库。