[发明专利]基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法、应用及固定化酶

说明书

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法、应用及固定化酶。该方法将基底蛋白的核苷酸序列和目标蛋白的核苷酸序列与断裂型内含肽两端的核苷酸序列分别连接，连接后分别进行融合表达；将融合表达后的基底蛋白制备成酶杂化纳米花，使基底蛋白被固定化；将固定化后的基底蛋白与融合表达后的目标蛋白混合，通过断裂型内含肽的反式自剪接功能直接进行特异性自组装，使目标蛋白被间接固定化。该方法将断裂型内含肽和酶杂化纳米花相结合，可将目标蛋白的纯酶或者粗酶液直接与固定化的基底蛋白结合，避免对蛋白构象的影响，高效便捷。该方法制备玉米赤霉烯酮降解的固定化酶，具有良好稳定性、催化效率和重复利用率。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法、应用及固定化酶。

背景技术

酶是一类重要的生物催化剂，具有催化效率高、底物特异性强以及反应条件温和等特点，被广泛应用于医药、化工、食品和环境等领域，但是许多天然酶的大规模制备比较困难，并且较难回收再使用，而且稳定性和对环境的敏感性都极大地制约了生物酶的大规模应用。为了提高酶的催化活性和稳定性，各种酶固定化技术不断涌现。酶固定后，与固定基质间相互作用可能会改变酶催化活性中心以外的空间结构，因此酶的固定化技术不仅可以改善酶的高效专一的催化活性，而且可以实现酶蛋白的重复回收，提高生物酶的利用率，降低酶使用成本，符合可持续发展战略的要求，酶固定化是酶工程发展的必然趋势。

近年来，酶杂化纳米花作为一种新型的酶固定化技术得到了广泛的研究和报道，它是利用生物矿化的原理通过自组装法实现酶的一步固定化。跟其他的酶固定化技术相比，酶杂化纳米制备简单具有高比表面积，能显著提升酶的稳定性、催化效率以及重复利用性，因此有望被广泛地应用于生物传感、制药、污染物处理等领域。

然而，单纯的采用酶杂化纳米花对目标蛋白进行直接固定化，则必须对目标蛋白进行纯化，而且由于固定化时间较长，可能会造成目标蛋白酶活降低。

内含肽(intein)是位于宿主蛋白质中的一段插入序列，内含肽不是一个独立的基因，必须插入于外显肽基因才能复制转录，可从前体蛋白中切除并将两侧外显肽连接起来成为成熟的具有活性的蛋白质。从内含肽的内部有无自导引归巢核酸内切酶结构域，可将内含肽分为2种类型：一种是全功能型内含肽，具有蛋白剪接活性和自导引核酸内切酶序列；另一种是微型内含肽，只有蛋白剪接活性。另外根据其存在形式，可以分为整体型内含肽和断裂型内含肽。整体型内含肽剪接区域都共同存在于同一多肽片段上，进行顺式剪接，断裂型内含肽的剪接区域分裂成两份或者更多片段，存在于不同的多肽片段上，进行反式剪接。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法、应用及固定化酶。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明提供一种基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法，包括以下步骤：将基底蛋白的核苷酸序列和所述目标蛋白的核苷酸序列与一种断裂型内含肽的两段核苷酸序列分别连接，连接后分别进行融合表达，得到融合表达后的基底蛋白和目标蛋白；将融合表达后的基底蛋白制备成酶杂化纳米花，使所述基底蛋白被固定化；将固定化后的所述基底蛋白与融合表达后的所述目标蛋白的纯酶或者粗酶液混合，通过所述断裂型内含肽的自剪接功能直接进行特异性自组装，使所述目标蛋白被间接固定化。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所用断裂型内含肽包括N端片段和C端片段；所述基底蛋白的核苷酸序列与所述N端片段的核苷酸序列连接，所述目标蛋白的核苷酸序列与所述C端片段的核苷酸序列连接。或者，所述基底蛋白的核苷酸序列与所述C端片段的核苷酸序列连接，所述目标蛋白的核苷酸序列与所述N端片段的核苷酸序列连接。

进一步，所述断裂型内含肽的所述N端片段和所述C端片段分别带有0-6个外显肽氨基酸。