[发明专利]基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法、应用及固定化酶

权利要求书

1.一种基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法，其特征在于，包括以下步骤：

将基底蛋白的核苷酸序列和目标蛋白的核苷酸序列与一种断裂型内含肽的两端核苷酸序列分别连接，连接后分别进行融合表达，得到融合表达后的基底蛋白和目标蛋白；

将融合表达后的基底蛋白制备成酶杂化纳米花，使所述基底蛋白被固定化；

将固定化后的所述基底蛋白与融合表达后的所述目标蛋白的纯酶或粗酶液混合，通过所述断裂型内含肽的反式自剪接功能直接进行特异性自组装，使所述目标蛋白被间接固定化。

2.根据权利要求1所述一种基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法，其特征在于，所用断裂型内含肽包括N端片段和C端片段；

所述基底蛋白的核苷酸序列与所述N端片段的核苷酸序列连接，所述目标蛋白的核苷酸序列与所述C端片段的核苷酸序列连接，或者，所述基底蛋白的核苷酸序列与所述C端片段的核苷酸序列连接，所述目标蛋白的核苷酸序列与所述N端片段的核苷酸序列连接。

3.根据权利要求2所述一种基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法，其特征在于，所述断裂型内含肽的所述N端片段和所述C端片段分别带有0-6个外显肽氨基酸。

4.根据权利要求3所述一种基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法，其特征在于，所述断裂型内含肽的所述N端片段和所述C端片段分别带有5个外显肽氨基酸。

5.根据权利要求1所述一种基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法，其特征在于，所述断裂型内含肽包括gp41-1、gp41-8、NrdJ-1、IMPDH-1中的一种。

6.根据权利要求1～5任意一项所述一种基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法，其特征在于，所述将融合表达后的基底蛋白制备成酶杂化纳米花的具体步骤为：

将融合表达后的所述基底蛋白加入到磷酸缓冲液中，并向所述磷酸缓冲液中加入无机金属盐溶液，在4℃-25℃放置36-60h，离心收集沉淀，并将所述沉淀用所述磷酸缓冲液清洗2-3次，得到所述基底蛋白的酶/磷酸盐杂化纳米花。

7.根据权利要求6所述一种基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法，其特征在于，所述无机金属盐溶液中的金属离子包括Ca²⁺，Cu²⁺，Zn²⁺，Mn²⁺中的一种。

8.根据权利要求6所述一种基于蛋白反式剪接的纳米固定化方法，其特征在于，反应体系中融合表达后的所述基底蛋白的终浓度为0.01-0.1mg/ml；反应体系中所述无机金属盐溶液的无机金属离子终浓度为5-10mM。

9.权利要求1～8任意一项所述的纳米固定化方法在固定玉米赤霉烯酮降解酶中的应用，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮降解酶为目标蛋白。

10.一种固定化酶，其特征在于，采用如权利要求1～8任意一项所述的纳米固定化方法制备；所述固定化酶为玉米赤霉烯酮降解酶的固定化酶。