[发明专利]一种重组SortaseA酶及其固定化方法和应用

说明书

本发明属于生物工程领域，具体公开了一种重组SortaseA酶及其固定化方法和应用，通过在SortaseA酶的末端引入一个半胱氨酸，利用巯基共价偶联的原理，将SortaseA酶固定到商品化的偶联树脂上，反应结束后，只需要通过简单的离心方法，即可将SortaseA酶去除，该方法大幅度地减少了操作的时间、实现了基本以零成本的方式去除了反应中多余的SortaseA酶，提高了SortaseA酶在蛋白质的合成与修饰中的应用价值。

技术领域

本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种重组SortaseA酶及其固定化方法和应用。

背景技术

从金黄色葡萄球菌中分离得到的转肽酶SortaseA可以特异性识别并结合蛋白质C端的LPXTG序列，切断苏氨酸和甘氨酸之间的肽键后，将其与另外一个N末端含有甘氨酸残基的肽链通过肽键相连。基于此功能，SortaseA酶可用于蛋白质的合成与修饰；

近年来，SortaseA已被广泛应用于蛋白质末端的修饰。利用SortaseA所催化的转肽反应，研究发现可以将任何感兴趣的水溶性修饰基团添加到蛋白质的末端，包括生物素、荧光素和交联剂等功能基团；

尽管SortaseA酶因为其转肽酶活性，广泛地应用于蛋白质的合成与修饰反应中，但是由于其还具有水解酶活性，其修饰后的产物又会被SortaseA作为底物重新被水解从而使修饰后的分子被掉落，即反应结束后SortaseA不易从反应体系中分离。目前解决的方案是通过及时将反应体系中多余的SortaseA去除的方式减少其水解反应的发生。常用的去除方法是在SortaseA的末端引入一个亲和标签，如6His，利用亲和吸附原理将酶与产物进行分离。该方法需要一步完整的亲和纯化过程，耗时长且成本较高，因此，本发明提供了一种利用半胱氨酸固定SortaseA酶的方法及其应用。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的首要目的在于提供一种重组SortaseA酶及其固定化方法和应用。

本发明的具体技术方案包括：

本发明提供了一种重组SortaseA酶，所述重组SortaseA酶是通过在SortaseA酶的C末端引入一个半胱氨酸进行序列改造得到的，该重组SortaseA酶的蛋白序列如SEQ IDNO.1所示。

作为本发明的进一步优化方案，表达重组SortaseA酶的载体为pET-28a，表达重组SortaseA酶的菌株为大肠杆菌BL21。

本发明还提供了如上述任一所述的重组SortaseA酶的编码基因，所述编码重组SortaseA酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种如权利要求上述所述的重组SortaseA酶在蛋白质的合成与修饰中的应用。

本发明还提供了一种如上述所述的重组SortaseA酶的固定化方法，利用半胱氨酸将SortaseA酶通过巯基偶联固定到商品化树脂上，所述商业化树脂中的碘乙酸基团与重组SortaseA酶暴露的巯基形成共价且不可逆硫醚键、并发生特异性高效反应，可永久性地将重组SortaseA酶连接到树脂上。

本发明还提供了一种如上述所述的固定化SortaseA酶在蛋白质的合成与修饰中的应用。

作为本发明的进一步优化方案，所述固定化SortaseA酶发挥蛋白修饰功能后，使用低速离心机，在3000rpm离心5min后即可去除固定化SortaseA酶。