[发明专利]硫辛酰化修饰位点的定量化学蛋白质组学方法

说明书

本申请涉及化学蛋白质组领域，尤其涉及硫辛酰化修饰位点的定量化学蛋白质组学方法，采用含醛基与炔基的探针对生物样品的蛋白质组进行硫辛酰化修饰的化学选择性标记；通过定量化学蛋白质组学技术，对化学选择性标记后的硫辛酰化修饰位点进行定量分析。可实现对生物样品中所有的硫辛酰化修饰位点的鉴定与定量，从而为研究硫辛酰化修饰对蛋白质结构和功能的影响提供分析工具，有利于推进硫辛酰化修饰对于相关疾病的分子机制的研究，可实现高覆盖度、高重现性以及高精确度的靶标筛选，为后续药物开发提供相应的技术支持。

技术领域

本申请涉及化学蛋白质组领域，尤其涉及硫辛酰化修饰位点的定量化学蛋白质组学方法。

背景技术

硫辛酰化修饰是一种通过酰胺键将硫辛酸共价连接到蛋白质赖氨酸残基上的翻译后修饰(posttranslational modification，简称PTM)，它是核心代谢途径(例如丙酮酸脱氢酶复合物、酮戊二酸脱氢酶复合物和支链酮酸脱氢酶复合物)中几种蛋白质复合物的活性中心，其作为关键的辅因子发挥着重要的催化作用。其中，丙酮酸脱氢酶复合物(PDH)是一种多功能酶复合物，其二氢硫辛酰胺转乙酰酶(E2)亚基上的硫辛酸中的两个硫原子通过氧化还原循环在二硫键与巯基之间相互转换，完成酰基转移、电子传递等催化过程，实现催化丙酮酸转化为乙酰辅酶A，至此将糖酵解过程与三羧酸循环联系起来。PDH的失调会导致人类产生代谢紊乱、癌症、和阿尔茨海默病等疾病。因此，推进对硫辛酰化修饰调节的理解对于研究这些疾病的潜在的分子机制具有重要的意义。

硫辛酰化修饰在进化上高度保守，在大肠杆菌和哺乳动物蛋白质组中分别只发现了3和5个硫辛酰化修饰蛋白(5和6个硫辛酰化修饰位点)。早期工作主要通过结构和生化的方法，如蛋白质免疫印迹、核磁共振图谱、氨基酸测序等对单个蛋白的硫辛酰化修饰进行研究。

而最新的基于质谱的方式也提供了研究不同细胞类型、组织和生物环境中特定赖氨酸残基的硫辛酰化修饰状态的手段。2019年Kajimura课题组整合抗硫辛酰化修饰抗体免疫沉淀方法和质谱的方法，对小鼠肩胛间棕色脂肪组织中的硫辛酰化修饰蛋白质进行鉴定。然而，由于抗体有限的结合，其亲和力不足以在严格的变性和洗涤条件下一直存在，并无法实现对所有的硫辛酰化修饰蛋白进行鉴定。在2021年，Xing Chen课题组整合基于碘乙酰胺辅助脂酸环辛炔连接(iLCL)的标记和质谱的方法，实现对大肠杆菌和小鼠细胞系中所有硫辛酰化修饰蛋白质进行鉴定。然而，该技术并未发展成为能够对硫辛酰化修饰位点进行鉴定的方法。而2014年，Cristea课题组通过靶向质谱的分析技术选择性反应监测准确地检测和量化不同生物样品中的硫辛酰化修饰水平，从而实现在体外和体内测量去硫辛酰化酶SIRT4的活性。靶向蛋白质质谱的分析已经成功地用于检测人类中的丙酮酸脱氢酶复合物中硫辛酰化修饰位点的定量。然而，目前所有技术均无法在蛋白质组水平上对所有的硫辛酰化修饰进行定量。因此，到目前为止，仍然缺乏一种特异性地用于全局分析蛋白质组中硫辛酰化修饰位点的定量方法。

发明内容

为了特异性地定量蛋白质组中所有的硫辛酰化修饰位点，本申请提供硫辛酰化修饰位点的定量化学蛋白质组学方法，通过采用含醛基与炔基的探针对生物样品的蛋白质组中硫辛酰化修饰进行化学选择性标记；再利用定量化学蛋白质组学技术，对化学选择性标记后的位点进行定量分析，可实现对生物样品中所有的硫辛酰化修饰位点的鉴定与定量；从而为研究硫辛酰化修饰对蛋白质结构和功能的影响提供分析工具，有利于推进硫辛酰化修饰对于相关疾病的分子机制的研究。

在一方面本申请提供一种硫辛酰化修饰位点的定量化学蛋白质组学方法，包括：

采用含醛基与炔基的探针对生物样品的蛋白质组进行硫辛酰化修饰的化学选择性标记；通过定量化学蛋白质组学技术，对化学选择性标记后的位点进行定量分析。

在一个实施方案中，所述生物样品包括：所述生物样品包括：大肠杆菌、酵母细胞、人源细胞系、人组织样本、人体器官、小鼠细胞系、小鼠组织样本、小鼠器官、果蝇细胞系、斑马鱼细胞系或线虫细胞系。