[发明专利]超高压联合热加工破坏大豆球蛋白A2肽链的抗原区域及定位方法

权利要求书

1.超高压联合热加工破坏大豆球蛋白A2肽链的抗原区域的氨基酸序列，其特征在于，所述抗原区域的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。

2.如权利要求1所述超高压联合热加工破坏大豆球蛋白A2肽链的抗原区域的氨基酸序列，其特征在于，所述抗原区域用T7噬菌体展示。

3.超高压联合热加工破坏大豆球蛋白A2肽链的抗原区域的定位方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)对大豆球蛋白进行超高压联合热加工处理，并将处理后的大豆球蛋白加入到大豆球蛋白多克隆抗体中，制得超高压联合热加工处理破坏的抗原表位特异性抗体；

(2)根据蛋白质三级结构及B细胞构象表位预测位置，将A2肽链的氨基酸序列分为3段，氨基酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示，设计A2肽链及其重叠分段的蛋白；

(3)以噬菌体展示技术研究超高压联合热加工破坏A2肽链蛋白的抗原区域，在噬菌体表面呈现A2肽链及其重叠分段的蛋白；

(4)利用间接竞争酶联免疫法，对超高压联合热加工处理导致A2肽链蛋白抗原性降低的区域进行精确定位，得到超高压联合热加工处理破坏最显著片段的氨基酸序列如SEQ IDNO.17所示。

4.如权利要求3所述的定位方法，其特征在于，所述超高压联合热加工处理的具体方法为：将浓度为10mg/mL的大豆球蛋白，置于无菌均质袋内，封口抽真空，将封闭好的均质袋置于超高压处理装置的处理腔内，处理温度为23℃；开始升压，升压速率为250MPa/min，当压强升至400MPa，保压15min，再卸压，卸压速率为300MPa/min；随后在130℃加热20min。

5.如权利要求3所述的定位方法，其特征在于，所述大豆球蛋白多克隆抗体的具体制备方法为：用纯化后的大豆球蛋白免疫新西兰大白兔，制备大豆球蛋白多克隆抗体。

6.如权利要求5所述的定位方法，其特征在于，所述大豆球蛋白的纯化方法为：将4mL大豆球蛋白血清与等量PBS溶液混合，缓慢加入4mL饱和硫酸铵溶液，使混合液饱和度达到50％；将混合液置于4℃冰箱中过夜，使血清中的免疫球蛋白充分沉淀，4℃、10000r/min离心30min后，取出沉淀；将沉淀用4mL PBS溶液重新溶解，加入2mL饱和硫酸铵溶液使饱和度为33％，在4℃离心30min后，取出沉淀；将沉淀重新溶解在2mL PBS溶液中，然后放入预处理过的透析袋中，4℃用PBS透析3天，每6h更换一次透析液，透析后置于-20℃保存。

7.如权利要求3所述的定位方法，其特征在于，所述间接竞争酶联免疫法的具体方法为：

用CBS缓冲液将权利要求3步骤(3)所得噬菌体蛋白稀释成50μg/mL包被于96孔板，每孔100μL，密封后4℃过夜，次日甩干孔内液体，加入150μL PBST缓冲液洗板，静置5min后拍干，重复清洗3次；用质量浓度为5％的BSA缓冲液于37℃封闭90min，用PBST缓冲液洗3次，每次5min；

每孔加入用PBS稀释1600倍权利要求3步骤(1)所得特异性抗体100μL，37℃孵育1h，洗板；每孔加入用封闭液稀释5000倍的羊抗兔酶标二抗100μL，37℃孵育1h后，洗板；每孔加入100μL TMB单组分显色液，37℃显色15min；每孔加入50μL 2mol/L H₂SO₄终止反应；在450nm下测定OD值。