[发明专利]一种靶向H1.4的sgRNA以及H1.4基因编辑方法

说明书

本发明涉及一种靶向组蛋白H1.4的sgRNA(single guide RNA，sgRNA)以及针对H1.4基因的编辑方法。所述靶向H1.4的sgRNA和H1.4基因编辑方法包括向肺癌细胞中导入抑制组蛋白H1.4表达的CRISPR/Cas9重组质粒，敲除肺癌细胞H1.4基因、调控肺癌细胞上皮‑间充质转化(EMT)进程，从而控制肺癌细胞的迁移和侵袭能力。本发明通过设计合成靶向H1.4的sgRNA以及CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除肺癌细胞组蛋白H1.4基因，促进肺癌细胞EMT进程，最终实现增强肺癌细胞的迁移和侵袭能力。由此可见，本发明可为阐明肺癌的发生发展提供一个新的理论依据，特别是为制备治疗肺癌的靶向药物提供一个新的靶点。

技术领域

本发明属于分子生物学和肿瘤生物学领域，涉及癌症的免疫治疗，具体涉及一种靶向H1.4的sgRNA以及H1.4基因编辑方法。

背景技术

在中国，肺癌是最常被诊断出的癌症。由于其攻击性行为和缺乏有效的早期筛查方法，大多数肺癌患者在诊断时处于中晚期。化疗是中晚期肺癌的基本治疗手段，但是肺癌发展进程较快，疗效不尽如人意，预后不佳等原因导致肺癌的致死率仍处于癌症致死率的第一位。这表明肺癌在生物医学界的研究仍是重中之重。

近年来，越来越多的研究偏向于通过对肺癌的发病机制和发展过程进行研究，并基于此寻找在其发生发展过程中的关键因子，从而为肺癌的诊断和治疗探寻可能的方法和途径。为此，深入研究及阐明NSCLC（非小细胞肺癌）是如何发生和怎样发展，为其早期的诊断和治疗提供有效的思路具有尤其重要的意义。

H1.4是接头组蛋白H1的十一种变体之一，编码基因长度为787bp，编码蛋白大小为34Kd，由219个氨基酸构成，结构特点为高度保守的球状结构域和较少保守的N-和C-末端尾巴。H1.4主要在体细胞中调控细胞周期，自身具有丰富的甲基化位点以及磷酸化位点。H1.4对肺癌的影响是有争议的，并且从很大程度上来说是未知的。随着表观基因组分析技术的进步，已经证明异常组蛋白修饰特别是乙酰化在EMT和癌症转移中起重要作用。目前关于H1.4的研究相对较少，我们推测，H1.4可能参与EMT过程，但其机制尚不清楚。

上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，是指上皮细胞改变细胞表型，失去细胞极性以及与基底膜之间的连接，从而转化为具有间充质表型的细胞，是恶性肿瘤发生侵袭和转移的基本发育过程。EMT主要表现为钙黏附蛋白E-cadherin被能够提供更大黏附连接力的N-cadherin蛋白所取代，波形蛋白Vimentin表达量的上调等。

CRISPR-Cas系统是原核生物的一种天然免疫系统。某些细菌在遭到病毒入侵后，能够把病毒基因的一小段存储到自身的DNA里一个称为 CRISPR 的存储空间。当再次遇到病毒入侵时，细菌能够根据存写的片段识别病毒，将病毒的DNA切断而使之失效。CRISPR-Cas系统包含CRISPR基因座和Cas基因（CRISPR关联基因）两部分。CRISPR是原核生物基因组内的一段重复序列。CRISPR全称Clustered Regularly Interspersed Short PalindromicRepeats（成簇的规律性间隔的短回文重复序列）。分布在40%的已测序细菌和90%的已测序古细菌当中。Cas基因位于CRISPR基因附近或分散于基因组其他地方，该基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用。因此，该基因被命名为CRISPR关联基因（CRISPRassociated，Cas）。CRISPR-Cas9基因编辑技术就是通过人工设计的sgRNA（single guideRNA）来识别目的基因组序列，并引导Cas9蛋白酶进行有效切割 DNA 双链，形成双链断裂，损伤后修复会造成基因敲除或敲入等，最终达到对基因组DNA 进行修饰的目的。

但是，目前并没有良好的能够促进人肺癌细胞EMT进程、增强人肺癌细胞迁移和侵袭能力的方法。

发明内容