[发明专利]一种新型AAV血清型及其制备方法

说明书

本发明公开了一种新型AAV血清型及其制备方法，新型AAV血清型的病毒衣壳蛋白包括VP1、VP2和VP3序列，VP3序列的3’末端为鹿或猪细小病毒序列的AAV VP3序列。本发明的新型AAV血清型的制备方法包括以下步骤：将鹿或猪细小病毒的VP3序列与AAV病毒的VP3序列进行比对，确定鹿或猪细小病毒序列可插入AAV病毒的VP3的氨基酸序列位点；将所有病毒外壳蛋白基因序列扩增后，按比例加入，进行无引物PCR反应；以PCR反应后的序列为模板进行全长PCR反应，获得目的条带；将目的条带无缝克隆进入病毒载体质粒，包装得到新型AAV血清型。本发明的新型AAV血清型制成的生物基因治疗药物进入人体后，能避免人体内可能预先存在的抗体对病毒与细胞的相互作用的干扰，提高基因治疗的效果。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是一种新型AAV血清型。

背景技术

腺相关病毒AAV的Cap蛋白为病毒衣壳蛋白，衣壳由三种亚基VP1、VP2和VP3按比例组成。VP1和VP2蛋白共享VP3序列，并在其N端具有其他残基。VP1的N端具有一个保守的磷脂酶A2序列，该序列与病毒从体内逃逸有关，并对其感染性至关重要；VP3蛋白的核心由保守的β-桶基序组成，决定了不同血清型AAV与宿主细胞作用受体的差异。许多人体内已经有野生型AAV抗体，因此可能已经有了预防AAV感染的方法。这些预先存在的抗体会干扰病毒与细胞的相互作用，并严重阻碍基因治疗的结果。

发明内容

本发明的第一个目的在于针对背景技术中所述的现有的AAV血清型在使用于人体时，人体内可能存在的野生型AAV抗体会干扰病毒与细胞的相互作用，影响基因治疗的效果的问题，提供一种能够解决前述问题的新型AAV血清型。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：新型AAV血清型，其病毒衣壳蛋白包括VP1、VP2和VP3序列，VP3序列的3’末端为鹿或猪细小病毒序列的AAV VP3序列。

本发明的第二个目的在于提供一种新型AAV血清型的制备方法，其包括以下步骤：

S1、将鹿或猪细小病毒的VP3序列与AAV病毒的VP3序列进行比对，确定鹿或猪细小病毒序列可插入AAV病毒的VP3的氨基酸序列位点；

S2、将所有病毒外壳蛋白基因序列扩增后，按比例加入，进行无引物PCR反应；

S3、以步骤S2中的PCR反应后的序列为模板进行全长PCR反应，获得目的条带；

S4、将目的条带无缝克隆进入病毒载体质粒，包装新型AAV血清型，得到的新型AAV血清型，新型AAV血清型的VP3序列的3’末端为鹿或猪细小病毒的AAV VP3序列。

作为上述方案的进一步改进，所述的AAV病毒为AAV2血清型病毒或AAV5血清型病毒。使用AA2血清型病毒或AAV5血清型病毒，都可以用于制备本发明的新型AAV血清型。

作为上述方案的进一步改进，所述的步骤S1中，AAV病毒的VP3序列为AAV2血清型病毒的VP3序列、AAV5血清型病毒的VP3序列，或是AAV2血清型和AAV5血清型的嵌合病毒的VP3序列，即为AAV2.5T序列。

作为上述方案的进一步改进，步骤S1中，鹿或猪细小病毒的VP3序列与AAV病毒的VP3序列进行比对时，比对其中的同源序列，找出的同源序列位点即为可插入鹿或猪细小病毒序列的氨基酸序列位点。

作为上述方案的进一步改进，步骤S2中，在病毒外壳蛋白基因序列中插入引物进行引物扩增，扩增后的基因经纯化回收后再混合进行无引物PCR反应。