[发明专利]一种同时分泌人IL-10和TGF-β的可示踪脐带间充质干细胞的制备及其应用

说明书

本发明涉及医学治疗技术领域，尤其涉及一种同时分泌人IL‑10和TGF‑β的可示踪脐带间充质干细胞的制备及其应用，包括以下步骤：步骤S01：构建pLV‑IL10(P2A)TGFb‑EGFP重组慢病毒质粒。本发明在经过测定之后，得出充质干细胞可分泌多种免疫抑制性的细胞因子、生长因子和趋化因子，可以广泛的应用在骨关节炎的治疗，且能够表达荧光报告基因，可通过活体成像技术实时追踪其在关节腔中的位置，存活时间，迁移，从而更方便准确地检测细胞在关节腔的药代动力学相关参数。

技术领域

本发明涉及医学治疗技术领域，特别是涉及一种同时分泌人IL-10和TGF-β的可示踪脐带间充质干细胞的制备及其应用。

背景技术

骨关节炎是一种常见的慢性退行性关节疾病，临床表现为关节疼痛、变形，行走障碍。骨关节炎患者关节软骨损伤后，形成局灶性病变，关节周围组织如滑膜逐渐被侵蚀，导致长期的滑膜慢性炎症。滑膜炎症虽然不是骨关节炎发病的直接诱导因素，但滑膜炎能够加剧软骨破坏，加快骨关节炎的发展。骨关节炎的早期到晚期，均伴有滑膜炎的发生与发展，关节腔镜和组织学检查表明滑膜是骨关节炎中发生炎性反应的主要部位。A型巨噬细胞是滑膜组织的主要组成细胞成分，在滑膜炎症中起到关键的作用。巨噬细胞可分为M1和M2，M1可简述为促炎性细胞，而M2是抑制免疫应答的调节性细胞，在不同的细胞因子微环境中二者可以相互极化。体外培养的环境下M2型巨噬细胞可通过IFN-g或LPS刺激极化为促炎性的巨噬细胞M1，在IL-10、IL-4、TGF-β等细胞因子的诱导下M1巨噬细胞可极化为免疫抑制性的M2巨噬细胞。M2型巨噬细胞不仅可以抑制炎性细胞免疫反应，还可以促进组织修复。通过治疗手段将滑膜组织中的巨噬细胞向M2极化将是有效治疗骨关节炎的重要手段之一。

间充质干细胞可分泌多种免疫抑制性的细胞因子、生长因子和趋化因子等可以调节免疫、促进组织损伤修复等功效。人脐带中间充质干细胞含量、增殖能力优于骨髓间充质干细胞，免疫原性比骨髓间充质干细胞低，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点，使其成为理想的再生医学研究和应用的功能细胞。近年来，脐带间充质干细胞在骨关节炎的治疗方面进行了大量的尝试，包括全身性的回输和局部的注射等治疗方式，均取得了良好的治疗效果。虽然间充质干细胞通过分泌多种免疫调节因子来抑制关节炎症性微环境，但是往往关键的免疫调节细胞因子分泌水平较低，导致了骨关节炎症状缓解周期较长，治疗效果往往需要依赖于多次的治疗。因而治疗成本较高，患者也会感到不便。另外，局部注射间充质干细胞的药代动力学参数仍然不是非常明确，需要通过更直观的手段去记录和检测间充质干细胞在局部的存活周期、聚集密度、迁移特点等药代动力学参数，为干细胞临床应用提供更加科学和严谨的数据支撑。

本发明构建了一种能够同时分泌IL-10和TGF-β细胞因子的脐带间充质干细胞，同时该细胞表达绿色荧光报告蛋白。文献报道，IL-10和TGF-β可以有效诱导M2型巨噬细胞，是巨噬细胞向M2极化的重要调节细胞因子，并且IL-10是抑制处于活化的T细胞、B细胞功能最强的调节性细胞因子。TGF-β能够诱导CD4+CD25-T细胞分化为Foxp3+调节性T细胞(Treg)细胞，并且维持Foxp3+Treg细胞的免疫抑制功能的重要细胞因子。因此，分泌高水平IL-10和TGF-β的脐带间充质干细胞用于骨关节炎的治疗，它将发挥以下几方面的作用：

(1)释放抑制性细胞因子刺激滑膜组织巨噬细胞向M2抑制性巨噬细胞极化，抑制免疫应答，降低炎性细胞因子水平，促进组织修复；

(2)诱导和维持Treg细胞在关节腔的形成和聚集，抑制促炎性免疫细胞反应，调节炎性免疫微环境；

(3)通过干细胞自身的的归巢和释放的生长因子等对损伤组织进行修复。以上三点作用机制将从根本上治愈骨关节炎临床。同时，本发明中构建的同时分泌IL-10和TGF-β脐带间充质干细胞能够表达荧光报告基因(绿色荧光蛋白EGFP)，可通过活体成像技术实时追踪其在关节腔中的位置、存活时间，迁移等等，从而更方便、准确地检测细胞在关节腔的药代动力学相关参数。

发明内容