[发明专利]一种同时分泌人IL-10和TGF-β的可示踪脐带间充质干细胞的制备及其应用

权利要求书

1.一种同时分泌人IL-10和TGF-β的可示踪脐带间充质干细胞的制备，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S01：构建pLV-IL10(P2A)TGFb-EGFP重组慢病毒质粒：通过获取5'端含有EcoR I酶切位点和克扎克序列，3'端包含BamH I酶切位点的IL-10-P2A-TGF-β1多顺反子，来获取IL-10-P2A-TGF-β1序列；将合成基因IL10(P2A)TGFb连接至pLV-EF1a-EGFP(2A)Puro质粒的EcoRI和BamH I之间，得到重组质粒pLV-IL10(P2A)TGFb-EGFP；

步骤S02：重组包装慢病毒：通过将293T细胞以5*10⁵个细胞/孔的密度接种于含有2mL慢病毒包装培养基的6孔培养板中，置于37℃，5％，CO₂条件下孵育细胞过夜，保证转染时细胞密度应达到60-70％汇合，完成细胞接种；然后第二天将所有质粒用Opti-MEM稀释至1ug/ul，进行转染制得重组慢病毒Lenti-IL10(P2A)TGF-β-EGFP，最后进行滴定测定，验证细胞体积；

步骤S03：制备IL-10/TGF-β分泌型脐带间充质干细胞：

(1)将人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)按照1*10⁵/孔接种至含2mL无血清干细胞培养基的6孔板中，将细胞培养板置37℃，5％CO₂培养箱孵育；

(2)待细胞密度达到60-70％，按照感染复数MOI＝5加入上述步骤S02中包装的慢病毒Lenti-IL10(P2A)TGF-β-EGFP；

(3)重组慢病毒感染hUC-MSC细胞24小时后，通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况，判断感染是否成功，并且通过流式细胞检测EGFP的阳性细胞比例；

(4)若结果显示，细胞均表达绿色荧光，阳性率达到93％，则说明成功制备IL-10/TGF-β分泌型脐带间充质干细胞hUC-MSC-IL-10/TGF-β，可通过荧光示踪。

2.根据权利要求1所述的一种同时分泌人IL-10和TGF-β的可示踪脐带间充质干细胞的制备，其特征在于，所述步骤S01中，5'端含有EcoR I酶切位点和克扎克序列，3'端包含BamHI酶切位点的IL-10-P2A-TGF-β1多顺反子的获取，具体包括以下步骤：

(1)从NCBI获取IL-10(Homo sapiens)的CDS序列；

(2)从NCBI获取TGF-β1(Homo sapiens)的CDS序列；

(3)获取P2A序列；

(4)根据上述三个序列，设计出5'端含有EcoRI酶切位点和克扎克序列，3'端包含BamHI酶切位点的IL-10-P2A-TGF-β1多顺反子序列。

3.根据权利要求1所述的一种同时分泌人IL-10和TGF-β的可示踪脐带间充质干细胞的制备，其特征在于，重组质粒pLV-IL10(P2A)TGFb-EGFP的具体操作方法如下：

(1)目的基因酶切；

(2)目的基因和线性化质粒回收；

(3)获得含重组慢病毒质粒pLV-IL10(P2A)TGFb-EGFP的连接产物；

(4)转化后进行质粒抽提，再经过双酶切鉴定和测序进行验证。

4.根据权利要求1所述的一种同时分泌人IL-10和TGF-β的可示踪脐带间充质干细胞的制备，其特征在于，转染制得重组包装慢病毒后，将收集上清转移至无菌的离心管，按照Lenti-X Concentrator：上清液1：3比例加入Lenti-X Concentrator，4℃孵育过夜，完成病毒浓缩；还需加入DMEM基础培养基重悬病毒沉淀，50ul/管分装，-80℃冰箱保存备用，限制分装病毒冻融次数。