[发明专利]特异性抗烟草PVY病毒的dsRNA及其体外合成引物和抗病性的应用

权利要求书

1.一种特异性抗烟草PVY病毒的dsRNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种体外合成权利要求1所述的特异性抗烟草PVY病毒的dsRNA的引物对，其特征在于，

正向引物PCP-F的核苷酸序列为：5’-GCAAATGACACAATCGATGC-3’，

反向引物PCP-P的核苷酸序列为：5’-TTGCCTAAGGGTTGGTTTTG-3’。

3.根据权利要求2所述的引物对，其特征在于，在所述正向引物和反向引物的5’端还均添加了T7启动子序列；

添加了T7启动子序列的正向引物PCP-T7F的核苷酸序列为：5’-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGCAAATGACACAATCGATGC-3’；

添加了T7启动子序列的反向引物PCP-T7P的核苷酸序列为：5’-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGTTGCCTAAGGGTTGGTTTTG-3’。

4.权利要求1所述的特异性抗烟草PVY病毒的dsRNA的体外合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、从感染PVY病毒的烟株叶片中提取烟草PVY病毒的总RNA，以总RNA为模板，反转录获得病毒样本的cDNA；

S2、以步骤S1所得cDNA为模板进行PCR扩增，纯化回收目的片段；

S3、将纯化回收的目的片段连接至载体上，再将载体加入感受态细胞中，培养扩增，挑取阳性克隆的CP蛋白，对CP蛋白进行测序，获得如SEQ ID NO.2所示的表达CP蛋白的PVY病毒靶基因序列；

S4、比对PVY病毒靶基因序列和已有PVY病毒靶基因序列，选取保守性较高区域的核苷酸序列；转录合成靶序列的正义链和反义链ssRNA，混合、退火得到dsRNA。

5.根据权利要求4所述的体外合成方法，其特征在于，步骤S2中PCR扩增的反应体系为：5μL含MgCl₂的10×PCR Buffer，1μL 10μmol/L dNTPs，10μmol/L的正反向引物各1μL，cDNA2μL，4U Taq DNA聚合酶，加灭菌ddH₂O至50μL；

反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，58℃退火45s，72℃延伸1min，循环30次后72℃延伸10min。

6.根据权利要求4所述的体外合成方法，其特征在于，步骤S3具体为：将目的片段连接至pMD-19T载体上，16℃反应4h；然后将连接产物加至DH5α感受态细胞中，冰上孵育30min，然后42℃热激转化90s，再加入LB液体培养基，37℃，200rpm摇菌2h；吸取菌液至含Amp⁺浓度为100mg/mL的LB固体培养基中，37℃培养过夜；挑取阳性克隆，进行测序获得表达CP蛋白的PVY病毒靶基因序列。

7.一种权利要求1所述的特异性抗烟草PVY病毒的dsRNA在防治烟草PVY病毒中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，取所述特异性抗烟草PVY病毒的dsRNA，使用用于PVY病毒接种的缓冲液配置成混合液，喷施或涂抹在烟草叶片上。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，使用所述特异性抗烟草PVY病毒的dsRNA配制的混合液时，喷施或涂抹的用量以dsRNA计为每片烟叶20μg。