[发明专利]一种魏氏柠檬酸杆菌yqjH基因敲除突变株及其应用

说明书

本发明公开了一种魏氏柠檬酸杆菌yqjH基因敲除突变株及其应用，属于基因工程领域。本发明首次提出魏氏柠檬酸杆菌(Citrobacter werkmanii)yqjH基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，并提出将魏氏柠檬酸杆菌的yqjH基因敲除而获得基因敲除突变株ΔyqjH，并保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为：GDMCCNo：62255，菌体的生物被膜形成能力得到提高。本发明还提供了突变株的培养条件，使突变株形成生物被膜的能力比野生型菌株最高提高了4.20倍，可应用于生物被膜工程领域，从而拓宽了魏氏柠檬酸杆菌用于环境重金属离子污染治理和构建生物被膜蛋白合成工厂等的应用场景和范围。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种魏氏柠檬酸杆菌yqjH基因敲除突变株及其应用。

背景技术

柠檬酸杆菌属的细菌是革兰氏阴性杆菌，兼性厌氧，代谢方式有呼吸和发酵两种类型，是人及动物的正常肠道栖居菌群，柠檬酸杆菌在自然环境分布极广，如土壤、水、污水和食物中，本实验室从工业腐败产品中分离到的魏氏柠檬酸杆菌(Citrobacterwerkmanii)，是柠檬酸杆菌属的细菌，贮藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 1.1242，该菌株兼性厌氧，具有一定的生物膜形成能力，但其形成的生物膜产量易受外界营养和环境条件的制约。

细菌生物被膜(BF)，是粘附于物品表面的细菌，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等，将其自身包裹而成的大量细菌聚集成庞大网络膜状物。细菌生物被膜是细菌为适应自然环境有利于生存的一种生命现象，由细菌及其分泌物积聚而成，其结构复杂，主要构成成分为：水、菌体、脂质、蛋白质、多糖、DNA、RNA等。激光共聚焦扫描显微镜技术观察BF独特的三维立体结构发现：细菌本身在生物被膜中仅占总体积的10％～20％，大部分是细菌分泌的粘性物质和胞外多糖。生物被膜的内部包含众多间隙和互通的通道，比表面积大，这赋予其强大的吸附能力和自我修复能力，细菌生物被膜这复杂特殊的结构，使得生物被膜内个体细菌比游离细菌的耐药性更强，被膜内的细菌不易被杀菌剂完全杀灭，一旦停用杀菌剂，耐药菌株迅速重新生成生物被膜，因此，除了细菌生物被膜具有一定的危害性以外，利用其比表面积，吸附力和生命力以及自我修复能力强的特点，可以对其进行开发利用，并已经成为在蛋白合成微工厂等领域应用的重要材料和载体。但上述应用必须以菌体能够形成足够多的生物被膜为基础，而如何提高生物被膜的形成量，一直是一个科研的难点和热点，另外，生物被膜的形成也受到外界营养和环境条件的影响和制约，寻找最佳的生物被膜形成条件，也应引起足够的重视。

yqjH基因与铁载体利用和铁调节相关，编码铁还原酶，可以催化铁螯合剂中三价铁还原为亚铁形式，从而铁载体释放铁到细胞质中，对维持铁在细胞中平衡有重要作用。该基因由yqhI控制转录。有报道称，枯草芽孢杆菌yqjH敲除后细菌对紫外照射敏感；鸭疫里默氏杆菌缺乏铁载体相互作用蛋白后其生物膜减少，毒力降低。目前没有魏氏柠檬酸杆菌中的yqjH基因的相关报道，其该基因在魏氏柠檬酸杆菌中可能具有重要的功能，可以使用基因工程等手段对其进行开发利用。

发明内容

本发明首次披露魏氏柠檬酸杆菌中的yqjH基因，并针对现有技术中魏氏柠檬酸杆菌在特定条件下生物被膜形成能力有限的不足，提供一种提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成的方法，具体是采取基因工程手段，对细菌如魏氏柠檬杆菌中的部分基因如yqjH进行改造和干预，研究发现可以提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜的形成量，从而提高其在环境治理和蛋白合成微工厂等方面的应用潜力。

本发明的第一个目的在于提供魏氏柠檬酸杆菌(Citrobacter werkmanii)中的yqjH基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该基因全长774bp，编码的蛋白有257个氨基酸序列。

本发明的第二个目的在于提供一种魏氏柠檬酸杆菌(Citrobacter werkmanii)yqjH基因敲除突变株，是将魏氏柠檬酸杆菌的yqjH基因敲除而获得，所述的yqjH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。