[发明专利]一种魏氏柠檬酸杆菌yqjH基因敲除突变株及其应用

权利要求书

1.一种魏氏柠檬酸杆菌（Citrobacter werkmanii）yqjH基因敲除突变株，其特征在于，是将魏氏柠檬酸杆菌的yqjH基因敲除而获得，所述的yqjH基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述的突变株是以魏氏柠檬酸杆菌GDFMZ BF-8为出发菌株，所述魏氏柠檬酸杆菌GDFMZ BF-8的保藏号为GDMCC No: 61858。

2.根据权利要求1所述的突变株，其特征在于，所述的突变株为魏氏柠檬酸杆菌（Citrobacter werkmanii） ΔyqjH，其保藏号为：GDMCC No：62255。

3.敲除yqjH基因和/或权利要求1-2任一项所述的突变株在提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成中的应用，所述的yqjH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的魏氏柠檬酸杆菌是魏氏柠檬酸杆菌GDFMZ BF-8，其保藏号为GDMCC No: 61858。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，是在提高魏氏柠檬酸杆菌在聚苯烯附着材料形成生物被膜中的应用。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述突变株的产生物被膜条件是：于25℃~37℃，在LB、TSB或NB培养基中培养。

6.一种增加魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成量的方法，其特征在于，将魏氏柠檬酸杆菌野生菌株中的yqjH基因敲除，所述的yqjH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的魏氏柠檬酸杆菌是魏氏柠檬酸杆菌GDFMZ BF-8，其保藏号为GDMCC No: 61858。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）以提取的魏氏柠檬酸杆菌野生株基因组DNA作为模板，分别以yqjH-up-F和yqjH-up-R，yqjH-down-F和yqjH-down-R为引物，扩增得到yqjH基因的上下游同源序列；

所述的引物yqjH-up-F的序列如SEQ ID NO.4所示，

所述的引物yqjH-up-R的序列如SEQ ID NO.5所示，

所述的引物yqjH-down-F的序列如SEQ ID NO.6所示，

所述的引物yqjH-down-R的序列如SEQ ID NO.7所示；

（2）用BglII单酶切pYG4质粒，并割胶回收，pYG4质粒的序列如SEQ ID NO.10所示；

（3）扩增得到的yqjH基因的上下游同源片段，连接到酶切后的质粒pYG4上，构建敲除载体pYG4-yqjH，然后热激转化大肠杆菌S17-1；

（4）将携带有敲除载体pYG4-yqjH的大肠杆菌S17-1与魏氏柠檬酸杆菌野生菌株共孵育，将共孵育物用敲除鉴定引物yqjH-QJ-F和yqjH-QJ-R鉴定yqjH基因一次交换重组子；

所述的引物yqjH-QJ-F的序列如SEQ ID NO.8所示，

所述的引物yqjH-QJ-R的序列如SEQ ID NO.9所示；

（5） 然后将一次交换重组子扩大培养，使用敲除鉴定引物yqjH-QJ-F和yqjH-QJ-R鉴定成功敲除魏氏柠檬酸杆菌yqjH基因的工程菌。