[发明专利]以G-四链体为猝灭基团于核酸适配体检测生物小分子的荧光检测试剂盒、使用方法及应用

说明书

本发明涉及一种以G‑四链体为猝灭基团于核酸适配体检测生物小分子的荧光检测试剂盒、使用方法及应用，属于生化分析技术领域。本发明基于G‑四链体对荧光染料具有较强猝灭作用的特性，利用靶标分子诱导富含G的核酸适配体形成G‑四链体等二级结构，且所形成G‑四链体等二级结构的量与靶标分子的浓度相关，从而以G‑四链体作为免标记的猝灭基团用于检测生物小分子。同时，核酸适配体的两端延长可形成互补碱基对的尾链，用于嵌入非标记荧光染料，并通过增加互补碱基的对数实现荧光信号的增大。本发明无需对核酸适配体进行标记，制作成本低，检测成本低，且检测原理简单，操作简便，降低了对操作人员的要求，更利于实际应用。

技术领域

本发明涉及生化分析技术领域，尤其涉及了一种以G-四链体为猝灭基团于核酸适配体检测生物小分子的荧光检测试剂盒。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

核酸作为细胞遗传信息的存储介质在生物系统中起到重要作用。在过去的几十年里，科学家们利用核酸的特殊结构和它的识别能力实现了各种科学研究或技术应用。其中，核酸的一个新兴的应用是开发核酸适配体(Aptamer)，核酸适配体最初是在20世纪90年代通过指数富集过程(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)系统配体进化而发现的。核酸适配体是能够和各种靶标物进行高亲和力、高特异性识别的单链DNA或RNA。由于核酸适配体良好的选择性和对靶标物的高亲和力，这使得它们在检测应用方面比传统的识别单元更加有优势，甚至可优于蛋白质抗体。因为它们通常在各种环境条件下更稳定，可重复使用，而且合成成本低，在合成和修饰上更简单。因此，核酸适配体可以替代传统抗体在基础研究、药物检测、临床诊断和各种疾病治疗方面具有广阔的应用前景。

G-四链体是最重要的非经典核酸二级结构之一，因为它们具有高度的稳定性和广泛的分布。G-四链体是由富含鸟嘌呤的寡核苷酸形成的特殊核酸二级结构。G-四链体的核心单元是G-四重体，由四个鸟嘌呤碱基通过Hoogsteen氢键连接而成。两个或多个鸟嘌呤四重体的堆叠形成G-四链体。与常以双螺旋结构存在的DNA双链不同，根据构成结构的寡核苷酸的序列以及核酸链的走向不同，G-四链体可以形成不同的拓扑结构。因其序列设计和结构灵活多变，G-四链体已经成为一种高灵敏度分析检测的重要单元。

荧光检测方法因其高灵敏度、简单的操作、检测所需时间短，在快速灵敏分析中展现出巨大的优势。现有技术有利于核酸适配体对生物小分子进行定量检测，但是需要对适配体进行标记，即在适配体的核苷酸上修饰荧光基团或猝灭基团。虽然修饰的荧光基团具有更稳定计量比的荧光响应，猝灭基团具有更高效率的猝灭性能，但是标记核酸将大大提高合成成本，增加检测成本。因此现在仍然需要开发一种操作简便、检测成本低的生物小分子检测方法。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种免标记荧光基团及猝灭基团的高效、简单、灵敏、选择性好、检测成本低的一种以G-四链体为猝灭基团于核酸适配体检测生物小分子的荧光检测试剂盒、使用方法及应用。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案是：

一种以G-四链体为猝灭基团于核酸适配体检测生物小分子的荧光检测试剂盒，包括以下溶液：

检测液：包括100-2000nM的检测用核酸，浓度为100-1000mmol/L、pH为4-10的缓冲溶液，质量分数为0.1％-10.0％的表面活性剂，防腐剂；其中检测用核酸包括两部分：1.可以识别待测生物小分子并形成G-四链体或富G二级结构的核酸适配体，2.由连接于核酸适配体两端的互补碱基序列形成的茎状结构，该茎状结构可嵌入荧光染料产生荧光。

荧光显色液：包括浓度为0.1×-10.00×免标记荧光染料(原始溶液浓度为10000×)；浓度为100-1000mM，pH为4-10的缓冲溶液。