[发明专利]一种高效分离纯化NKT细胞的免疫学方法

说明书

本发明提供了一种高效分离纯化NKT细胞的方法，涉及免疫学、分子生物学、分子免疫学等技术领域。所述分离纯化的方法包括：1)T细胞的分选；2)NKT细胞的分选；3)NKT细胞的纯度鉴定的验证；4)分选中脾脏细胞数目的选择；本发明得到了高纯度的NKT细胞，为NKT细胞在心血管、肿瘤、自身免疫疾病的细胞免疫治疗方面具有极为深远的意义。

技术领域

本发明涉及免疫学、分子生物学、分子免疫学等多项领域。具体包括T细胞的分选、NKT细胞的分选、NKT细胞的纯度鉴定。

背景技术

自然杀伤T细胞(natural killer T cells，NKT)作为一类特殊的T细胞亚群，在固有和获得性免疫中均发生着重要作用。在小鼠体内，NKT细胞被定义为 CD3+NK1.1+NKT；在人体中NKT细胞被定义为CD3+CD56+NKT。NKT细胞既表达T细胞受体(TCR)，又表达NK细胞受体。NKT细胞既可以促进细胞介导的抗肿瘤、抗感染作用，又可以通过调节免疫耐受防止自身免疫性疾病的发生。作为先天免疫和适应性免疫的桥梁，NKT细胞在很多病理条件下发挥作用。目前NKT细胞发挥其作用主要依靠3种途径：1.经抗原激活后，NKT细胞可通过自身分泌细胞因子如IFN-γ、IL-4、IL-10等发挥效应；2.NKT细胞被激活后，可释放穿孔素、颗粒酶；3.激活的NKT细胞，释放的相关细胞因子会激活邻近的NK细胞、B细胞和抗原提呈细胞。当NKT细胞被激活后，大量表达多种细胞因子，包括IFNγ，IL-15，IL-18和TNFα等促炎症因子以及IL-4,IL-10和IL-13 等抗炎症因子。这些细胞因子一方面能够直接作用于NKT细胞，发挥细胞毒性作用，另一方面够反式激活其他免疫细胞，如自然杀伤T细胞、B细胞等，发挥免疫调节作用。因此现多认为NKT细胞能够介导保护性和调节性免疫功能，在肿瘤、感染以及自身免疫疾病中发挥调节作用。

现如今，细胞免疫治疗法蓬勃发展。作为一种新兴的生物治疗方法，细胞免疫治疗法是指通过过继输注体外诱导扩增的自体细胞，可以有效的调控机体免疫平衡，恢复机体免疫系统的功能紊乱。细胞国际转移治疗为免疫细胞系统失衡所导致的多种疾病，如肿瘤、自身免疫性疾病及心血管疾病的治疗提供了非常重要的研究思路。因此，获取特定的具有功能的免疫细胞用于细胞免疫治疗的研究具有重要作用。

CD3⁺CD56⁺NKT细胞作为一类新的细胞毒性效应细胞兼有T淋巴细胞强大的免疫活性和NK细胞的非MHC限制性广谱免疫作用，且对骨髓造血系统影响小的优点，是目前血液系统肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病过继性免疫治疗中常用的细胞，被认为是过继性细胞免疫治疗的首选方法。但目前NKT细胞的分离提纯仍存在较大的难度。

因此，发明一种高效分离纯化NKT的方法，对自身免疫性疾病、肿瘤以及心血管疾病的治疗具有及其重要的意义。

发明内容

本发明提供了一种高效分离纯化NKT细胞的方法，其具体步骤包括：

1.小鼠脾脏中T细胞的分离纯化：

1)C57小鼠脾脏中T细胞的分离纯化

(1)C57小鼠用水合氯醛麻醉后处死，置于75％乙醇中浸泡数分钟。

(2)解剖小鼠，取出脾脏，将脾脏置于钢网上，加入PBS溶液，研磨。

(3)研磨后，收集脾脏细胞悬液于15mL离心管中。

(4)在室温条件下，1500-1800rpm，5min进行离心操作。

(5)离心完毕后，弃去上清，加入3mL红细胞裂解液，重悬。

(6)裂解5分钟后，1500-1800rpm，5min进行离心操作。

(7)离心完毕后，弃去上清，再次加入3mL红细胞裂解液，重悬。