[发明专利]一种利用ThioGlo1荧光探针检测角蛋白的方法

说明书

本发明公开了一种一种利用ThioGlo1荧光探针检测角蛋白的方法，其特征在于，是将ThioGlo1荧光探针和角蛋白在液体环境下混合进行反应，然后检测发射波长λ_em＝510nm左右的荧光强度，激发波长λ_ex＝340nm，判定是否有角蛋白或其浓度。本发明使用ThioGlo1荧光探针对废弃羊毛角蛋白和废弃鸡毛角蛋白的检测非常灵敏，且荧光强度正比于废弃角蛋白浓度，可指示废弃角蛋白的存在或定量测定废弃角蛋白的浓度。本发明还可以用于快速筛选角蛋白降解菌，为此类菌的高通量筛选奠定了基础。

技术领域：

本发明属于角蛋白检测领域，具体涉及一种利用ThioGlo1荧光探针检测角蛋白的方法。

背景技术：

角蛋白主要存在于羊毛、羽毛、头发、指甲、角和蹄中(质量分数高达90％以上)，是最丰富和未充分开发的蛋白质来源。据统计，全球年产羽毛超过6500万吨，其中羊毛超过250万吨。我国每年家禽加工业及羽绒制品生产企业的富含角蛋白的副产物，通常采用填埋或燃烧的方法处理，只有少量被简单转化成肥料和饲料等。由于角蛋白的含硫量高，采用填埋或燃烧的方法会给环境造成严重污染。而且角蛋白是由18种氨基酸组成的多肽，具有很好的生物相容性、可降解性、可再生性、成膜性和抗拉性能。因此对角蛋白的开发利用不仅能减少环境污染，同时也能产生极大的经济效益。但是，因为角蛋白分子内形成的立体网状结构，存在大量的二硫键，使天然角蛋白难以溶解于一般的溶液中，给角蛋白的提取带来困难。要得到溶解性较好的角蛋白，只能通过选择性的打开二硫键等方法来实现。在实验中，不论使用何种方法降解来得到可溶角蛋白或进一步利用的多肽产物，通过对打开的二硫键(硫醇)的检测以定性定量检测二硫键的打开程度，可快速、有效的检测可利用角蛋白的产量，以提高对角蛋白的利用效率。尤其在生物法降解角蛋白的过程中，检测打开二硫键的数量可为下游的处理工艺提供依据，从而可以实现快速筛选角蛋白降解菌株的目的，为生物技术领域内此类菌的高通量筛选打下基础。

目前，对于硫醇检测的强有力工具是荧光标记技术，该技术具有高时空分辨率、灵敏度高、选择性好、快速反应等优势。在过去几十年中，多种类型的硫醇(疏基)标记试剂，比如N-取代马来酰亚胺、二亚胺、芳基卤化物，苯并呋喃磺酰卤和邻苯二甲醛等都已经被相继报道(L.Y.Niu,Y.Z.Chen,H.R.Zheng,L.Z.Wu,C.H.Tung,Q.Z.Yang.Chem.Soc.Rev.,2015,44,6143–6160；T.Matsumoto,Y.Urano,T.Shoda,H.Kojima,T.Nagano.Org.Lett.2007,9,17,3375–3377)。N-取代马来酰亚胺体系是一类比较稳定且适用于高效液相色谱分析的巯基衍生试剂。其检测是基于巯基和双键的加成反应来检测硫醇，且该反应是室温和生理pH下快速完成(J.Y.Sun,L.W.Zhang,X.L.Zhang,Y.S.Hu,C.P.Ge,J.G.Fang.Analyst,2016,141,2009–2015)。N-取代马来酰亚胺类荧光探针主要包括香豆素类、噻吨类、苯并杂环类，还有一些以芘、吖啶、萘胺衍生物等作为荧光基团的N-取代马来酰亚胺类。其中香豆素衍生物荧光探针ThioGlo1(结构式如式1所示)具有较弱的荧光且荧光发射波长大于蛋白质自身的荧光发射波长。而且此荧光探针在量子产率及斯托克斯位移等方面显著优于其它已报道的荧光试剂(N.Ercal,P.Yang,N.Aykin.J.Chromatogr.B 753,2001,287–292)。

发明内容：

为了实现快速判断废弃角蛋白的存在或定量测定废弃角蛋白疏基浓度的目的，本发明提供了一种简便、快捷的利用ThioGlo1荧光探针检测角蛋白的方法。