[发明专利]一种抑制稻瘟病菌的关键基因、dsRNA及其制备和应用

权利要求书

1.一种抑制稻瘟病菌关键基因，其特征在于，所述抑制稻瘟病菌关键基因为MoCytb、MoRic8、MoTrx2、MoMBF1或MoEnd3中的任意一种，其中，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9所示。

2.一种权利要求1所述的抑制稻瘟病菌关键基因的特异性基因，其特征在于，所述特异性基因为抑制稻瘟病菌关键基因去掉内含子的特异性基因，其核苷酸序列分别如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10所示。

3.一种权利要求1所述的抑制稻瘟病菌关键基因的dsRNA，其特征在于，所述抑制稻瘟病菌关键基因的dsRNA为含有T7启动子的MoCytb基因的dsRNA、MoRic8基因的dsRNA、MoTrx2基因的dsRNA、MoMBF1基因的dsRNA或MoEnd3基因的dsRNA中的任意一种，其核苷酸序列分别在序列SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10前增加T7启动子序列TAATACGACTCACTATAGGG。

4.根据权利要求3所述的抑制稻瘟病菌关键基因的dsRNA，其特征在于，所述抑制稻瘟病菌关键基因的dsRNA中的特异性21nt序列合成sRNA，进行2'-O-甲基修饰或者硫代磷酸酯(PS)骨架修饰得到修饰的增强型ds-sRNA：ds-sCytb-Ome和ds-sCytb-SOme，所述21nt序列分别为SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ IDNO.16所示。

5.一种权利要求3所述的体外转录合成方法，其特征在于，所述合成步骤如下：

(1)dsRNA模板准备：利用权利要求2所述特异性基因作为模板，用含有T7启动子的上下游引物序列进行PCR扩增，纯化后得到模板，将纯化模板采用试剂盒进行转录；

(2)DNase处理：步骤(1)转录后，加入转录酶混匀；

(3)转录RNA的精制：将混合液转入离心管内，加入苯酚、氯仿、异戊醇混合液，震荡离心取上清液；吸取上清液于新的离心管中再加入的氯仿、异戊醇混合液，震荡离心取上清液；取得上清液与醋酸钠和异丙醇混合，室温静置后离心弃上清液，加乙醇洗净沉淀，再加入无菌水溶解沉淀后放入超低温冰箱保存。

6.根据权利要求5所述dsRNA的合成方法，其特征在于，步骤(1)所述含有T7启动子的dsRNA的上下游引物分别为MoCytb-T7-F和MoCytb-T7-R，MoRic8-T7-F和MoRic8-T7-R，MoTrx2-T7-F和MoTrx2-T7-R，MoMBF1-T7-F和MoMBF1-T7-R，MoEnd3-T7-F和MoEnd3-T7-R，其对应的序列为SEQ ID NO.17-26。

7.根据权利要求4所述dsRNA的合成方法，其特征在于，步骤(3)所述苯酚、氯仿和异戊醇体积比为25～28:25～28:1～5。

8.一种权利要求3或权利要求4所述抑制稻瘟病菌关键基因的dsRNA在抑制稻瘟病中的应用。

9.一种权利要求3或权利要求4所述抑制稻瘟病菌关键基因的dsRNA在制备抑制稻瘟病菌的抑制制剂中的应用。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抑制稻瘟病采用体外喷雾侵染，将含稻瘟病菌和dsRNA的溶液均匀喷洒于三叶期的水稻幼苗上，培养后观察表型。