[发明专利]一种提高热稳定性和抑制剂耐受性的逆转录酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种提高热稳定性和抑制剂耐受性的逆转录酶突变体及其应用，该逆转录酶突变体是在如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中取代如下位置的氨基酸，具体包括L139P，T197A，G308C，D524G和L603W；或者包括L139P，T197A，G308C，D524G、L603W和D209A。本发明构建的两种突变体与野生型相比，热稳定性有显著提高，耐热能力可达60℃以上；持续合成能力好，同时对多种抑制剂的耐受性显著增强，具有广泛的应用前景和市场价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高热稳定性和抑制剂耐受性的逆转录酶突变体及其应用。

背景技术

逆转录酶[EC 2.7.7.49]是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA(cDNA)的DNA聚合酶，大多来源于以RNA为遗传物质的逆转录病毒，在真核生物中也有发现。逆转录酶是一种具有三种酶活性的多功能酶，包括RNA和DNA依赖性的DNA聚合酶活性，以及催化RNA-DNA杂合链中RNA降解的RNase H活性。在生物医学领域，逆转录酶被广泛用于病毒RNA检测、基因表达与功能分析、cDNA文库制备、RNA测序等方面，是应用最为广泛的生物医药工具酶之一。

目前，分子生物学中使用的大多数逆转录酶来源于禽成髓细胞瘤病毒(AvianMyeloblastosis Virus,AMV)或莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia virus,M-MLV)。AMV逆转录酶是异源二聚体，热稳定性较好，但具有较强的RNase H活性，可降解RNA:cDNA复合物中的RNA，因此产率较低，通常只能产生较短的cDNA片段(5kb)。而M-MLV逆转录酶是一种单体结构酶，生产与改造更为方便，其反应温度约为37℃。虽然M-MLV的热稳定性低于AMV逆转录酶，但其RNA酶H活性较低，因此具有更高的长cDNA(7kb)合成效率。使用M-MLV逆转录酶仍是市场的主流方向。

野生型M-MLV逆转录酶最适反应温度为37℃，在此温度下单链RNA容易自身配对形成发夹等复杂二级结构，阻碍逆转录反应的进行；同时，逆转录酶自身具有的RNase H活性会降解RNA-DNA双链中的RNA，使RNA模板在全长逆转录完成之前就被降解。因此第一代逆转录酶的反应时间长(60分钟)，cDNA产率低，持续合成能力低(不超过7kb)，对逆转录抑制剂的耐受性也不好，已逐步被市场所淘汰。

目前逆转录试剂的最主要产品为美国Invitrogen公司(已被ThermoFisher收购)的SuperScript系列产品，占领了国内半数以上的市场。由于进口试剂价格昂贵，市场仍缺乏成本低、性能优良的国产逆转录试剂；所以开发一种热稳定性高、合成性能好、抑制剂耐受性能好的逆转录酶突变体十分重要。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种提高热稳定性和抑制剂耐受性的逆转录酶突变体，并具备较高持续合成能力。

本发明还提供所述逆转录酶突变体的应用。

技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种提高热稳定性和抑制剂耐受性的逆转录酶突变体，所述逆转录酶突变体是在如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中取代如下位置的氨基酸，具体包括：以脯氨酸取代第139位的亮氨酸(L139P)，以丙氨酸取代第197位的苏氨酸(T197A)，以半胱氨酸取代第308位的甘氨酸(G308C)，以天冬酰胺取代第524位的天冬氨酸(D524G)，以色氨酸取代第603位的亮氨酸(L603W)。

作为优选，所述突变体还包括以丙氨酸取代第209位的天冬氨酸(D209A)。

本领域的技术人员可以通过定点突变、基因合成等各种常规生物学技术得到本发明所述的逆转录酶突变体编码基因，并通过常规的重组表达和蛋白纯化技术获得本发明所述逆转录酶突变体蛋白。