[发明专利]一种提高热稳定性和抑制剂耐受性的逆转录酶突变体及其应用有效
| 申请号： | 202210300872.4 | 申请日： | 2022-03-25 |
| 公开（公告）号： | CN114657165B | 公开（公告）日： | 2023-04-07 |
| 发明（设计）人： | 张旭宁;刘杨;邓锐;程槐旭;高尊昉 | 申请（专利权）人： | 江苏百时美生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N9/12 | 分类号： | C12N9/12;C12P19/34 |
| 代理公司： | 南京苏高专利商标事务所(普通合伙) 32204 | 代理人： | 孙斌 |
| 地址： | 222005 江苏省连云*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 提高 热稳定性 抑制剂 耐受 逆转录 突变体 及其 应用 | ||
1.一种提高热稳定性和抑制剂耐受性的逆转录酶突变体，其特征在于，所述逆转录酶突变体是在如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中取代如下位置的氨基酸，以脯氨酸取代第139位的亮氨酸 (L139P)，以丙氨酸取代第197位的苏氨酸 (T197A)，以半胱氨酸取代第308位的甘氨酸 (G308C)，以甘氨酸取代第524位的天冬氨酸 (D524G)，以色氨酸取代第603位的亮氨酸 (L603W)。
2.一种提高热稳定性和抑制剂耐受性的逆转录酶突变体，其特征在于，所述逆转录酶突变体是在如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中取代如下位置的氨基酸，以脯氨酸取代第139位的亮氨酸 (L139P)，以丙氨酸取代第197位的苏氨酸 (T197A)，以半胱氨酸取代第308位的甘氨酸 (G308C)，以甘氨酸取代第524位的天冬氨酸 (D524G)，以色氨酸取代第603位的亮氨酸 (L603W)，以丙氨酸取代第209位的天冬氨酸 (D209A)。
3.一种如前述权利要求1或者2所述的逆转录酶突变体在逆转录反应中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，逆转录反应体系包括逆转录酶、逆转录反应缓冲液、RNA模板、引物、dNTP 、DTT 、RNA酶抑制剂、无核酸酶水。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述逆转录反应体系包括200 U/μL逆转录酶1μL、5×逆转录反应缓冲液4 μL、RNA模板50 ng - 1μg、引物终浓度2.5 μmol/L、10mmol/L dNTP 1 μL、0.1 mol/L DTT1 μL、40 U/μL RNA酶抑制剂 1 μL、无核酸酶水补充到20μL。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，逆转录反应条件为50℃温育30 min；若使用随机引物，先25℃温育5 min，然后50℃温育30 min；若目的cDNA长度小于3 kb，温育时间缩短为10 min；反应结束后，85℃加热5 min以终止反应。
7.一种含有权利要求1或者2所述的提高热稳定性和抑制剂耐受性的逆转录酶突变体的试剂盒。
8.一种权利要求7所述的试剂盒在各种复杂RNA模板的逆转录中的应用。
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